Протоонкоген превращается в онкоген и без участия вируса (опыты)
Важную роль в становлении концепции онкогенов сыграли классические опыты по обнаружению мутантных клеточных генов, способных вызывать опухолевую трансформацию при трансфекции "нормальных"клеток. Я взял в кавычки слово нормальные, потому что в этих опытах использовали мышиные клетки NIH3T3. Я раньше успел вам сказать, что эти клетки были уже иммортализованы т.е. содержали мутации, предрасполагающие их к трансформации. Эти опыты показали, что превращение протоонкогена в онкоген может происходить и без участия вирусного "захвата" , а просто, как и следует из простого здравого смысла, в результате мутаций клеточных генов. Опыты заключались в следующем:
1. Из опухолевых клеток человека (в первый раз это делали с линией клеток, полученной от карциномы мочевого пузыря) выделили ДНК, раздробили ее на фрагменты длиной около 50 000 п.о.. Фрагменты осадили, добавив к раствору в фосфатном буфере хлористый кальций. В результате образовывался фосфат кальция, с которым соосаждалась ДНК.
2. Эта суспензия была вылита на монослой NIH3T3 клеток. В результате ДНК проникала внутрь клеток и встраивалась случайным образом в их геном. (Вы видите здесь один из распространенных способов введения чужеродной ДНК в клетки). В результате некоторые из клеток монослоя образовали опухолевые клетки, которые размножались быстрее и образовывали характерные "комки", так называемые фокусы. Это были первичные трансформанты. Ясно, что в каждой клетке первичных трансформантов содержалось большое количество встроенной человеческой ДНК. Найти среди этого множества именно те кусочки, которые ответственны за трансформацию, было невозможно. Поэтому был сделан следующий шаг.
3. Из первичных трансформантов выделяли ДНК и повторяли с нею все процедуры, описанные в пп 1 и 2. Зачем? Понятно. Если получатся снова трансформанты, то в них уже будет мало человеческой ДНК, поскольку 3Т3 клетки мышиные и вторая ДНК выделена из них, то в ней сравнительно мало человеческой ДНК. Следовательно, вероятность ее попадания в трансформированную клетку низка. Поэтому если образуются новые опухолевые фокусы то в них содержание той ДНК человека, которая реально ответственна за опухолевое превращение, будет повышено. Трансформанты действительно образовались. Процедуру повторяли несколько раз. Таким образом с каждым разом уменьшали вероятность найти в трансформантах случайную ДНК человека, оставляя только ту человеческую ДНК, которая и вызывала трансформацию. Вопрос был как ее найти в массе мышиной ДНК.
4. Для идентификации человеческой ДНК в массе мышиной использовали тот же прием, который мы уже видели, когда идентифицировали человеческие клоны в библиотеках генов, получаемых из гибридных клеток человека и грызуна. Человеческая ДНК отличается от ДНК мыши тем, что в ней содержатся часто повторяющиеся Alu последовательности, которых нет у мыши. Поэтому из трансформантов, полученных после нескольких последовательных пассажей ДНК, описанных в пп 1- 3, была получена библиотека генов. В этой библиотеке путем гибридизации с Alu пробой, меченной фосфором, были найдены клоны, содержащие человеческую ДНК.
5. В конечном счете был идентифицирован трансформирующий ген, последовательность которого оказалась очень похожей на последовательность одного из известных к тому времени ретровирусных онкогенов - онкогена ras, содержащегося в вирусе саркомы Харви (Harvey sarcoma virus). Но ген, выделенный из трансформированных клеток, был типичным клеточным геном, содержащим интроны. И тогда стало ясно, что это клеточный аналог этого "Ha-ras" гена.
Этот онкоген получился из клеточного гена, протоонкогена, в результате точечной мутации, о которой мы поговорим позже. Точечной мутации, не связанной с захватом клеточной ДНК ретровирусом, а существовавшей в клеточной ДНК, которую использовали для трансфекции. Стало ясно, что онкогены могут возникать не только при захвате клеточных генов вирусами и их изменений в составе вирусов, но и прямо в результате мутаций этих генов в их родном геноме.
