Белки: определение первичной последовательности
Определение аминокислотной последовательности полипептидной цепи основано на принципах, которые были развиты Сэнгером [ Sanger F, 1952 ]. Они используются и сегодня, правда со всевозможными вариациями и усовершенствованиями. Чтобы расшифровать аминокислотную последовательность любого полипептида, необходимо осуществить шесть основных стадий:
Стадия 1, - определение аминокислотного состава.
Первым шагом на пути к расшифровке аминокислотной последовательности служит гидролиз всех пептидных связей чистого полипептида. Образующаяся смесь аминокислот анализируется затем при помощи ионообменной хроматографии , что позволяет определить, какие аминокислоты и в каком соотношении присутствуют в гидролизате.
Стадия 2, - идентификация амино- и карбокси- концевых остатков.
Следующий шаг состоит в идентификации аминокислотного остатка, находящегося на конце полипептидной цепи, несущего свободную альфа-аминогруппу,т.е. на аминоконце ( NH2 - конце, или N-конце). Для этой цели Сэнгер предложил использовать реагент, <1-фтор-2,4-динитробензол>, который можно присоединить в качестве метки к аминоконцевому (N- концевому) остатку цепи, в результате чего образуется окрашенное в желтый цвет 2,4-динитрофенольное (ДНФ) производное полипептида. При кислотном гидролизе все пептидные связи в таком ДНФ-производном расщепляются, однако ковалентная связь между альфа-аминогруппой N-концевого остатка и 2,4-динитрофенильной группой остается незатронутой. Следовательно, N-концевой остаток будет представлен в гидролизате в виде 2,4-динитрофенильного производного. Это производное легко отделить от незамещенных свободных аминокислот и идентифицировать хроматографическим способом путем сравнения его с аутотентичными динитрофенильными производными различных аминокислот. Карбоксиконцевой (С- концевой) аминокислотный остаток тоже можно идентифицировать, используя тот или иной метод. Один из таких методов состоит в инкубировании полипептида с карбоксипептидазой, которая гидролизует только пептидную связь находящуюся на карбоксильном конце (С-конце) цепи. Определив, какая из аминокислот первой отщепилась от полипептида, при действии на него карбоксипептидазы, можно идентифицировать С-концевой остаток.
В результате идентификации N- и С- концевых остатков полипептида получают две важных реперных точки для определения его аминокислотной последовательности (первичной структуры).
Стадия 3, - расщепление полипептидной цепи на фрагменты.
Берется еще одна порция анализируемого препарата, содержащего неповрежденные полипептидные цепи и расщепляются на более мелкие куски - короткие пептиды, состоящие в среднем из 10-15 аминокислотных остатков. Наиболее распространенный метод для проведения такого расщепления - это частичный ферментативный гидролиз пептида под воздействием пищеварительного фермента трипсина. Этот фермент обладает высокой специфичностью действия: гидролизу подвергаются только те пептидные связи, которые образованы между карбоксильной группой лизина или аргинина и аминогруппой любой аминокислоты. Число мелких фрагментов, образующихся под действием трипcина, можно, таким образом, предсказать, зная общее число остатков лизина и аргинина в исходном полипептиде. При этом все мелкие пептиды, кроме одного, должны иметь на карбоксильном конце остаток лизина или аргинина. Фрагменты, образовавшиеся под воздействием трипсина, разделяют методом ионообменной хроматографии на колонке, либо при помощи электрофореза и хроматографии на бумаге. Часто проводят двумерное хроматографическое разделение на листе бумаги, в результате чего получают хроматограмму с распределившимися на ней пептидами в виде пептидной карты.
Стадия 4, - определение последовательности пептидных фрагментов
На этой стадии устанавливается аминокислотная последовательность в каждом из пептидных фрагментов, полученных на стадии 3. Для этой цели обычно используют химический метод, разработанный Пером Эдманом [ Edman PV,1967 ]. Расщепление по Эдману сводится к тому, что метится и отщепляется только N-концевой остаток пептида, а все остальные пептидные связи не затрагиваются. После идентификации отщепленного N- концевого остатка метка вводится в следующий, ставший теперь N- концевым,остаток, который точно также отщепляется, проходя через ту же серию реакций. Так, отщепляя остаток за остатком, можно определить всю аминокислотную последовательность пептида, используя для этой цели всего одну пробу. В методе Эдмана вначале пептид взаимодействует с фенилизотиоционатом, который присоединяется к свободной альфа-аминогруппе N- концевого остатка. Обработка пептида холодной разбовленной кислотой приводин к отщеплению N- концевого остатка в виде фенилтиогидантоинового производного, которое можно идентифицировать хроматографическими методами. Остальная часть пептидной цени после удаления N- концевого остатка оказывается неповрежденной. Операция повторяется столько раз сколько остатков содержит пептид. Таким способом можно легко определить аминокислотную последовательность пептидов, содержащих 10-20 аминокислоных остатков. Определение аминокислотной последовательности проводится для всех фрагментов, образовавшихся под действием трипсина. После этого возникает следующая проблема, - определить в каком порядке располагались фрагменты в первоначальной полипептидной цепи.
Стадия 5,- расщепление исходной полипептидной цепи еще одним способом
Чтобы установить порядок расположения пептидных фрагментов, образовавшихся под действием трипсина, берут новую порцию препарата исходного полипептида и расщепляют его на более мелкие фрагменты каким-либо другим способом, при помощи которого расщепляются пептидные связи устойчивые к действию трипсина. Для этой цели предпочтительнее оказывается не ферментативные, а химические методы. Хорошие результаты дает обработка препарата бромцианом, расщепляющим только те пептидные связи, в которых карбонильная группа принадлежит остатку метионина. Каждый из полученных коротких пептидов подвергается последовательному расщеплению по методу Эдмана ( также как на стадии 4) и таким путем устанавливают их аминокислотную последовательность.
Стадия 6, - установление порядка расположения пептидных фрагментов по перекрывающимся фрагментам.
Аминокислотные последовательности в пептидных фрагментах, полученных двумя способами, сравнивают, чтобы во втором наборе найти пептиды, в которых последовательности отдельных участков совпадали бы с последовательностями тех или иных участков пептидов первого набора. Пептиды из второго набора с перекрывающимися участками позволяют соединить в правильном порядке пептидные фрагменты, полученные в результате первого расщепления исходной полипептидной цепи.
Иногда второго расщепления полипептида на фрагменты оказывается недостаточно, для того чтобы найти перекрывающиеся участки для всех пептидов, полученных после первого расщепления. В этом случае применяется третий, а иногда и четвертый способ расщепления, чтобы получить в конце концов набор пептидов, обеспечивающих полное перекрывание всех участков и установление полной последовательности аминокислот в исходной полипептидной цепи.
