ATP-зависимая димеризация двух Rad50cd способствует связыванию ДНК
Мы изучили воздействия ATP на димеризацию двух Rad50cd с помощью аналитического центрифугирования (AUC) и динамического рассеяния света (DLS) ( Рис 1B ). Измеренная при AUC масса - 31 кДа без ATP и 66 кДа - с ATP, что указывает на ATP-зависимую димеризацию Rad50cd. DLS показало среднюю молекулярную массу (MW) 33-38 кДа без ATP и 55-60 кДа с ATP, что согласуется с гомодимерной ассоциацией двух элонгированных Rad50cd (структуры см. ниже). NBD ABC-переносчиков гомологичны по последовательности Rad50 и очевидно функционируют как димеры ( Nikaido Ames, 1999 ). Электронномикроскопические исследования и воссоздание субъединицы гликопротеина P не выявили наличия контакта между двумя NBD ( Rosenberg и др., 1997 ). Наши результаты могут объяснить это несоответствие в том случае, если димеризация NBD опосредуется ATP и поддерживает цикл ATP-зависимой ассоциации/диссоциации для ABC- переносчиков ( Liu и др., 1999 ).
Мы определили нуклеотидспецифичность димеризации Rad50cd с помощью DLS ( Рис 1B ). В отсутствии нуклеотидов или в присутствии АДФ, GTP или ЦТФ обнаруживаемая MW составляла 35-40 кДа, что соответствует мономеру Rad50cd. В присутствии ATP, дATP или негидролизуемого аналога ATP AMP-PMP MW составляла 60-65 кДа, что соответствовало гомодимеру Rad50cd. Нуклеотидспецифичность соответствует специфичности нуклеотидзависимого связывания ДНК для эукариотического Rad50 ( Raymond и Kleckner, 1993 ). Оба эксперимента показали близкую корреляцию между связыванием ATP и димеризацией, а также между димеризацией и связыванием ДНК Rad50.
Для проверки влияния ATP на связывание ДНК Rad50cd мы провели эксперименты по сдвигу электрофоретической подвижности с использованием dsДНК в присутствии и в отсутствии ATP ( Рис 1C ). В присутствии ATP Rad50cd обнаруживает большую ДНК-связывающую активность. В отсутствии ATP связывание ДНК было слабым и возникало лишь при высоких концентрациях белка. Большое увеличение молекулярной массы комплекса ДНК-Rad50cd было полностью обратимо при использовании SDS; таким образом, это увеличение не является результатом белок-независимой аггрегации ДНК или ковалентного связывания.
