TRADD более сильный индуктор сигнала TRAF2 чем TNF-рецептор
Более высокое сродство взаимодействия TRADD-TRAF2 (Kd = 7,8 mM) по сравнению с взаимодействиями между TRAF2 и рецепторными пептидами (Kd = 40 mM-1,0 mM) ( Ye и Wu, 2000 ) предполагает, что TRADD может являться более сильным индуктором сигнала TRAF2. Для проверки этой гипотезы мы сравнили сигнал TRAF2 от TNFR1, сигнал, опосредуемый TRADD и таковой от TNFR2 (Kd = 0,5 mM для взаимодействия TNFR2-TRAF2), прямой рецепторный сигнал, поскольку как TNFR1 , так и TNFR2 с высоким сродством связываются с растворимым TNFальфа .
Поскольку клетки многих типов экспрессируют как TNFR1, так и TNFR2, мы выделили фибробласты мышиных эмбрионов с недостаточностью по TNFR1 ( Pfeffer и др., 1993 ) или по TNFR2 ( Erickson и др., 1994 ) для получения клеток, содержащих лишь один из TNF-рецепторов. Вначале было определено количество рецепторов TNF для каждого типа фибробластов для нормализации сигнала TRAF2. Было измерено связывание каждого типа фибробластов с меченым I-125 TNFальфа в отсутствии и в присутствии избытка "холодного" TNFальфа. Анализ данных по связыванию показал, что дефектные по TNFR1 фибробласты содержат приблизительно 3800 TNFR2 на клетку при константе диссоциации 0,09 nM, а также то, что TNFR2-дефектные фибробласты содержат ~9600 TNFR1 на клетку при константе диссоциации в 0,07 nM.
Поскольку на дефектных по TRAF2 мышах и трансгенных мышах, экспрессирующих доминантно-негативную форму TRAF2 , показано, что TRAF2 является главным активатором JNK посредством TNFальфа ( Lee и др., 1997 ; Yeh и др., 1997 ), мы использовали активацию JNK как следствие опосредованной TRAF2 сигнальной трансдукции. Первичные фибробласты эмбрионов были обработаны TNFальфа мыши и уровни содержания дважды фосфорилированного JNK определялись по истечении 10 и 30 минут стимуляции с использованием специфических анти-фосфо-JNK-антител. В содержащих TNFR1 фибробластах уровень активации JNK существенно выше, чем в TNFR2-содержащих фибробластах , таким образом, TRADD - более эффективный инициатор сигнала TRAF2. Более высокий уровень сигнала TRAF2, осуществляемый с помощью TNFR1, также указывает на эффективное взаимодействие между доменом смерти TRADD и TNFR1. Любопытно, что, как было показано, в отсутствии активации рецептора домен смерти TNFR1 связан с белком-"глушителем" для подавления его тенденции к сигналу ( Jiang и др., 1999 ).
