Альфоидная ДНК: Хромосомоспецифичные семейства : общие сведения
Детальная характеристика хромосомоспецифичного семейства обычно включает:
1) Определение нуклеотидной последовательности ПЕВП .
2) Определение степени гомогенности индивидуальных ПЕВП семейства.
3) Оценка размера домена, занимаемого данным хромосомоспецифичным семейством, который определяется копийностью присутствующей в нем ПЕВП.
4) Выяснение степени специфичности данного семейства к одной или нескольким хромосомам методом гибридизации in situ в условиях различной жесткости. При отсутствии данных о нуклеотидной последовательности некоторое представление о структуре ПЕВП может дать рестрикционный анализ. Рестриктаза, имеющая один сайт узнавания в пределах ПЕВП, разрезает весь хромосомоспецифичный домен на фрагменты одинаковой длины, образуя так называемый рестрикционный повтор . Этот повтор выявляется при блот-гибридизации в жестких условиях альфоидной пробы с тотальной ДНК человека, гидролизованной подходящей рестрикционной эндонуклеазой. Степень гомогенности внутри данного семейства определяется при секвенировании нескольких независимо полученных копий данной ПЕВП. Этот параметр обычно сходен во всех семействах. Как указано выше, различия между индивидуальными ПЕВП, как правило, не превышают 1- 5%. [ Willard, Waye, 1987b ].
Копийность ПЕВП определяют одним из двух методов: определение числа копий по интенсивности гибридизации [ Carine et al., 1989 ] и оценка размера альфоидного домена с помощью электрофоретического фракционирования фрагментов альфоидной ДНК в пульсирующем поле [ Mahtani, Willard, 1990 ].
Результаты, полученные первым методом, существенно зависят от условий гибридизации. В условиях "низкой жесткости" возможна перекрестная гибридизация с другими близкородственными хромосомоспецифичными семействами, в чрезмерно "жестких" условиях альфоидный фрагмент может слабо гибридизоваться с членами своего хромосомоспецифичного семейства, несколько отличающимися по структуре. Предполагается, что такие вариантные последовательности присутствуют на краях альфоидных доменов [ Smith, 1976 ].
Таким образом, этот метод может давать существенно искаженные результаты. Кроме того, разными авторами используются различные условия гибридизации, что существенно затрудняет сравнение данных, полученных из разных источников при помощи этого метода.
Метод оценки размера фрагментов с помощью электрофореза в пульсирующем поле требует подбора рестрикционной эндонуклеазы, которая не имеет сайтов узнавания в пределах ПЕВП, а следовательно, и всего альфоидного домена, состоящего из таких единиц. Появление сайтов такой рестриктазы связано с изменением последовательностей ДНК за пределами альфоидного домена. В результате может быть определен размер всего домена вместе с фланкирующими последовательностями. Обычно эти последовательности невелики, и данный фрагмент достаточно точно соответствует участку, занимаемому хромосомоспецифичным семейством. Однако при соседстве двух различных повторяющихся доменов, лишенных сайтов данной рестриктазы, они могут вырезаться в виде одного фрагмента. Чтобы уменьшить вероятность ошибки такого рода, для анализа используют несколько рестриктаз.
Размер альфа-сателлитных доменов всегда характеризуется высокой степенью полиморфизма. Размер фрагментов выявляется при блот-гибридизации фракционированной по размеру тотальной ДНК человека с альфоидной пробой [ Marcais et al., 1991a ; Waye et al., 1987a ].
Для определения хромосомной специфичности альфа-сателлитной последовательности используют гибридизацию in situ [ Юров, 1984 ] либо блот-гибридизацию по Саузерну с гидролизатами ДНК однохромосомных соматических гибридов [ Willard, 1985 ].
Хромосомоспецифичные семейства большинства хромосом не имеют близкородственных последовательностей даже в пределах своего надхромосомного семейства. Однако, некоторые хромосомы могут содержать очень близкие или даже практически неразличимые последовательности. Так, например, хромосомы 13 и 21 содержат очень схожие альфоидные семейства, различающиеся только периодичностью рестриктных сайтов [ Devilee et al., 1986 ; Jorgensen et al., 1987 ; Jabs et al., 1991 ]. Последовательности этих семейств гомологичны между собой более чем на 97% и в условиях различной жесткости гибридизуются с обеими хромосомами. Такие же парные семейства имеются на хромосомах 14 и 22 [ Jorgensen et al., 1988 ], 5 и 19 [ Hulsebos et al., 1988 ] и, возможно, других. Создание методов, позволяющих дифференцировать последовательности подобных "парных" хромосомоспецифичных семейств разных хромосом, в большинстве случаев представляет собой серьезную проблему. Более подробно этот вопрос будет рассмотрен в разделе II.4.1.1 . В результате ряда делеций или дупликаций, происходящих внутри исходного типа ПЕВП, размер и структура ПЕВП могут быть изменены. Измененные таким образом варианты ПЕВП присутствуют во множестве копий, образуя субдомены внутри альфоидного домена, состоящего из исходного типа ПЕВП. Механизмы возникновения и размножения таких измененных повторяющихся единиц будут рассмотрены ниже.
