Антигены HLA: клеточные методы определения
После распознавания чужеродного антигена начинается пролиферация Т-лимфоцитов. Этот процесс можно воспроизвести in vitro в смешанной культуре лимфоцитов, состоящей из лимфоцитов донора и реципиента. Если донор и реципиент несут разные антигены HLA класса II, в смешанной культуре отмечается пролиферация. Чтобы оценить иммунный ответ лимфоцитов только одного из исследуемых (отвечающих клеток), лимфоциты другого (стимулирующие клетки) инактивируют облучением или митомицином. Смешанная культура лимфоцитов позволяет выявить различия по антигенам HLA, которые нельзя обнаружить серологическими методами, например различия по антигенам HLA-DP и HLA-DQ.
Смешанная культура лимфоцитов. Равное количество лимфоцитов донора и реципиента смешивают и инкубируют в течение 5 суток при температуре 37 градусов по Цельсию, затем добавляют 3Н-тимидин, который встраивается в ДНК пролиферирующих клеток. В присутствии 3Н-тимидина лимфоциты инкубируют еще 1сутки, после чего определяют радиоактивность отвечающих клеток. В качестве отрицательного контроля используются культуры, состоящие только из отвечающих клеток, в качестве положительного - культура отвечающих клеток, стимулированных смесью лимфоцитов от разных доноров. Если радиоактивность в смешанной культуре превышает радиоактивность в отрицательном контроле не более чем на 20% или составляет не более 20% от радиоактивности в положительном контроле, считают, что донор и реципиент совместимы по антигенам HLA класса II.
Для определения одновременно 3 антигенов HLA класса II (HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DR) с помощью смешанной культуры лимфоцитов в качестве стимулирующих клеток используют лимфоциты, несущие известные антигены HLA-DP, HLA-DQ и HLA-DR от гомозиготных по ним доноров. Обычно эти доноры рождаются от близкородственных браков. Если гомозиготные стимулирующие клетки не вызывают пролиферацию отвечающих клеток в смешанной культуре лимфоцитов, значит, отвечающие клетки несут те же антигены HLA класса II. Таким образом, смешанная культура лимфоцитов позволяет оценить совместимость донора и реципиента без анализа антигенов HLA (с применением стимулирующих клеток неизвестного фенотипа) и определить одновременно 3 антигена HLA класса II (с применением гомозиготных стимулирующих клеток).
Реакция клеточной цитотоксичности. При совместном культивировании лимфоцитов реципиента (отвечающих клеток) и отличающихся от них по антигенам HLA класса II стимулирующих клеток среди отвечающих клеток появляются цитотксические Т-лимфоциты. Они способны разрушать клетки-мишени, несущие антигены, которые присутствуют на стимулирующих клетках. Изучение клеточной цитотоксичности в смешанной культуре лимфоцитов в ряде случаев позволяет предсказать, будет трансплантат стимулировать образование цитотоксических Т-лимфоцитов или нет. Для этого готовится смешанная культура лимфоцитов, где отвечающими клетками служат лимфоциты реципиента, а стимулирующими - инактивированные лимфоциты донора. После 6 суток инкубации смешанной культуре лимфоцитов к отвечающим клеткам добавляют свежие клетки того же донора, меченные 51Cr. Клетки реципиента и меченые клетки донора смешиваются в соотношениях 100:1, 50:1 и 10:1. После инкубации в течение 4 ч отбирают надосадочную жидкость и измеряют в ней содержание радиоактивной метки, вышедшей из разрушенных клеток донора. Отрицательным контролем служат меченые клетки донора. Метод можно использовать как до, так и после трансплантации. В последнем случае повышении активности цитотоксических Т-лимфоцитов свидетельствует об отторжении трансплантата.
Основной недостаток методов, основанных на смешанной культуре лимфоцитов, - большие затраты времени (около недели). Для более быстрого получения результатов отвечающие клетки в смешанной культуре лимфоцитов предварительно активируют известными антигенами HLA класса II. Для этого необходима панель лимфоцитов с разными антигенами HLA класса II. Кроме того, методы, основанные на применении смешанной культуры лимфоцитов, плохо воспроизводимы, поэтому, если необходимо выбрать одного из нескольких доноров, смешанные культуры с лимфоцитами, полученными от всех доноров, готовят одновременно. Если использовать гомозиготные стимулирующие клетки, они должны быть выделены непосредственно перед исследованием. Уже отмечалось, что доноров гомозиготных клеток очень мало, поэтому исследования с использованием этих клеток проводятся только в специализированных лабораториях. С помощью реакции клеточной цитотоксичности предсказать отторжение трансплантата можно далеко не во всех случаях, поэтому этот метод не получил широкого распространения.
