Антигены HLA: проба на индивидуальную совместимость
Завершающий этап подбора донора - проведение пробы на индивидуальную совместимость. В основе пробы на индивидуальную совместимость лежит лимфоцитотоксический тест . Для этого к лимфоцитам донора добавляют сыворотку реципиента. Цель исследования - выявить любые антитела, которые могут реагировать с антигенами HLA донора и вызвать сверхострое отторжение трансплантата. Сверхострое отторжение обусловлено взаимодействием антител с антигенами HLA донора, находящимися на эндотелии трансплантата. Образовавшиеся комплексы активируют комплемент, который повреждает эндотелий и тромбоциты, приводя к тромбозу сосудов трансплантата .
Положительный лимфоцитотоксический тест свидетельствует о высоком риске не только сверхострого, но и острого и хронического отторжения трансплантата .
Острое отторжение обусловлено образованием антител, хроническое - появлением цитотоксических Т-лимфоцитов, направленных против антигенов донора.
Сыворотка реципиента для проведения пробы на индивидуальную совместимость должна быть получена не более чем за 1 месяц до исследования. Дополнительно можно исследовать более ранние пробы сыворотки - иногда это позволяет выявить антитела, которые присутствовали в сыворотке реципиента в низком титре, а к моменту последнего забора крови исчезли. В этом случае обычно исследуют пробу сыворотки, содержащей наибольшее количество антител к разным антигенам HLA. Единого мнения о целесообразности исследования сывороток, полученных более чем за 6 месяцев до проведения пробы, нет. Считается, что оно необходимо, если у реципиента ранее обнаружились антитела ко многим антигенам HLA или в прошлом он уже перенес трансплантацию. При этом обычно исследуется 2-6 проб сыворотки. Ложноположительные результаты лимфоцитотоксического теста возможны при наличии в сыворотке реципиента аутоантител, перекрестнореагирующих с лимфоцитами донора. Присутствие аутоантител подтверждается при смещивании сыворотки реципиента с его собственными лимфоцитами. Аутоантитела не повышают риск отторжения трансплантата.
Для выявления в сыворотке реципиента антител к антигенам HLA донора дополнительно проводят следующие исследования:
- Сыворотку реципиента смешивают с суспензией лимфоцитов и моноцитов донора и добавляют комплемент. Для повышения чувствительности исследования увеличивают время инкубации. Поскольку в суспензии содержится около 70% Т-лимфоцитов и 30% В-лимфоцитов и моноцитов, положительный результат данного исследования свидетельствует о том, что в сыворотке реципиента присутствуют как антитела к антигенам HLA класса I , так и антитела к антигенам HLA класса II .
- Лимфоцитотоксический тест с Т-лимфоцитами позволяет выявить только антитела к антигенам HLA класса I. Поскольку выделить из крови Т-лимфоциты относительно просто, это исследование широко распространено. Если в сыворотке реципиента обнаруживаются IgG к Т-лимфоцитам, трансплантация от этого донора абсолютно противопоказана.
- Лимфоцитотоксический тест с В-лимфоцитами позволяет выявить антитела к антигенам HLA как класса I, так и класса II, поскольку В-лимфоциты несут на своей поверхности антигены обоих классов. Лимфоцитотоксический тест с В-лимфоцитами более информативен, чем с Т-лимфоцитами, поскольку на поверхности В-лимфоцитов больше антигенов класса I. Исследование часто проводится с разными разведениями сыворотки реципиента. Это позволяет определить титр антител к антигенам HLA донора. Если он превышает 1:4, то высок риск сверхострого отторжения трансплантата.
- Проточная цитофлюориметрия также позволяет определить титр антител к антигенам HLA донора. Метод заключается в следующем. Лимфоциты донора инкубируют с сывороткой реципиента, после чего к смеси добавляют меченные флюоресцентной меткой антитела к иммуноглобулинам человека. Присутствующие в сыворотке донора антитела связываются с лимфоцитами, а затем - с мечеными антителами. Результат исследования выражают в виде гистограммы. По оси абсцисс откладывают интенсивность флюоресценции, по оси ординат - число флюоресцирующих клеток. На рис. 17.3 представлены гистограммы, полученные при исследовании отрицательного и положительного контролей, а также сыворотки, содержащей антитела к антигену HLA класса I. Использование моноклональных антител к уникальным антигенам клеток, например CD3 Т-лимфоцитов или CD20 В-лимфоцитов , позволяет исследовать отдельные популяции клеток. Чтобы отличить эти антитела от антител к иммуноглобулинам человека, их метят разными флюоресцепными метками. Например, чтобы выявить антитела к антигенам HLA класса I, связавшиеся только с Т-лимфоцитами, суспензию лимфоцитов и моноцитов донора смешивают с сывороткой реципиента, затем добавляют антитела к человеческим IgG, меченные флюоресцеином (зеленое свечение), и моноклональные антитела к CD3, меченные фикоэритрином (красное свечение). Таким образом, Т-лимфоциты, несущие исследуемые антигены HLA класса I, одновременно испускают красное и зеленое свечение. Чувствительность проточной цитофлюориметрии примерно в 100 раз превышает чувствительность серологических методов. Однако высокая чувствительность приводит к тому, что помимо антител к антигенам HLA выявляется множество других антител сыворотки реципиента, реагирующих с лимфоцитами донора, например аутоантител. В связи с этим положительный результат проточной цитофлюориметрии при определении антител к антигенам HLA требует дополнительных исследований.
- Исследование с дитиотреитом и дитиоэритритом. Считается, что основную роль в отторжении трансплантата играют IgG , а не IgM. IgM часто (хотя не всегда) являются аутоантителами, направленными к антигенам, не относящимся к HLA. IgM вызывают отторжение трансплантата крайне редко (в большинстве лабораторий IgM к антигенам HLA не определяют). IgM связывают комплемент, что обуславливает положительный лимфоцитотоксический тест . Для инактивации IgM используют дитиотреит или дитиоэритрит, они разрушают дисульфидные связи между мономерами в пентамерной молекуле IgM. Если при исследовании антител к антигенам HLA в сыворотке, обработанной дитиотреитом или дитиоэритреитом, получен отрицательный результат, то в ней отсутствуют IgG, которые могли бы вызвать отторжение.
- Проба на индивидуальную совместимость при высоком и низком риске отторжения трансплантата. К группе больных с высоким риском отторжения трансплантата относятся реципиенты, ранее иммунизированные антигенами HLA ( коэффициент серопозитивности превышает 15%), и реципиенты, ранее перенесшие трансплантацию, независимо от коэффициента серопозитивности в данный момент. Следует помнить, что отсутствие антител к антигенам HLA в сыворотке реципиента не исключает его иммунизации этими антигенами. В этом случае после трансплантации органа активируются клетки памяти и синтез антител возобновляется. В связи с этим при высоком риске отторжения перед трансплантацией исследуются несколько проб сыворотки реципиента, полученных в разные периоды времени. Больным с высоким риском отторжения трансплантата обычно проводят лимфоцитотоксические тесты с Т- и В-лимфоцитами и проточную цитофлюориметрию с использованием нескольких проб сыворотки. К группе больных с низким риском отторжения трансплантата относят реципиентов, которым трансплантацию проводят впервые, а также реципиентов, в сыворотке которых нет антител к антигенам HLA или они присутствуют в низком титре.
- Оценка пробы на индивидуальную совместимость ( табл. 17.4 ).
При этой оценке проверяют 4 положения:
- У всех реципиентов исключают наличие аутоантител, поскольку они обуславливают ложноположительную пробу на индивидуальную совместимость. При выявлении аутоантител их инактивируют дитиотреитом или удаляют абсорбцией на лимфоцитах реципиента или другого человека и только после этого повторно проводят пробу.
- Если в сыворотке реципиента обнаружены IgG к Т-лимфоцитам донора, трансплантацию органа, полученного от данного донора, не проводят.
- При положительном результате лимфоцитотоксического теста с В-лимфоцитами необходимы дополнительные исследования для определения класса антигенов HLA, против которых направлены антитела реципиента. В этом случае обычно проводят проточную цитофлюориметрию с Т-лимфоцитами. Положительный результат этого исследования свидетельствует о том, что сыворотка реципиента содержит антитела к антигенам HLA класса I. Отрицательный результат проточной цитофлюориметрии с Т-лимфоцитами указывает на присутствие в сыворотке реципиента антител к антигенам HLA класса II. Единого мнения о том, допустима ли трансплантация органов при наличии в сыворотке реципиента антител к антигенам HLA класса II, в настоящий момент нет. Однако у реципиентов с низким риском отторжения трансплантата и низким титром данных антител трансплантация обычно проходит успешно.
- Если при положительном результате проточной цитофлюориметрии с Т-лимфоцитами донора результаты лимфоцитотоксического теста с сывороткой реципиента и лимфоцитами донора отрицательны, результаты исследования оценивают с учетом того, к какой группе риска относится реципиент. Так, если реципиент относится к группе риска отторжения трансплантата, положительный результат проточной цитофлюориметрии служит противопоказанием к трансплантации органа, полученного от данного донора. В остальных случаях трансплантация возможна.
