Ангиогенин: влияние на синтез ДНК
В ранних работах по изучению митогенного действия АНГ показано, что сам АНГ не является прямым митогеном для эндотелиальных, гладкомышечных клеток и фибробластов. Однако он обладает способностью усиливать митогенный эффект сред, кондиционированных другими типами клеток, на гладкомышечные клетки сосудов и фибробласты, и оказывает ингибирующее влияние на способность таких сред стимулировать синтез ДНК в эндотелиальных клетках [ Heath W.F. et al., 1989 ].
Так, бессывороточная среда DMEM/F-12 , кондиционированная в течение 24 ч лимфобластами крови IM-9 , почти в 2 раза стимулирует включение [3H]тимидина в покоящиеся субконфлюэнтные ВАСЕ-клетки (эндотелиальные клетки капилляров коры надпочечников быка) по сравнению с контрольной (некондиционированной) средой. Среда, кондиционированная этими же клетками, но в присутствии АНГ, прогрессивно, по мере увеличения концентрации АНГ (0.01-1000 нг/мл), утрачивает свой стимулирующий эффект. Опыты, в которых кондиционированную среду и АНГ добавляли одновременно, свидетельствуют об отсутствии непосредственного влияния АНГ на поглощение тимидина.
Наблюдается пролонгированное действие АНГ на клетки, используемые для кондиционирования сред. Так, бессывороточная среда DMEM/F-12, кондиционированная в течение 48 ч мышиными адипоцитами 3T3-L1 , обладает стимулирующим эффектом (-165% от контроля) на включение тимидина в ВАСЕ-клетки. Среда же, кондиционированная в течение 48 ч отмытыми адипоцитами, предварительно инкубированными 48 ч с АНГ (0.01-1000 нг/мл ), прогрессивно утрачивает стимулирующий эффект (вплоть до его полного исчезновения) [ Heath W.F. et al., 1989 ] ( рис. 8а ). Предполагается, что АНГ подавляет выделение адипоцитами митогенов для эндотелиальных клеток и, по всей вероятности, является ингибитором выделения митогенов для эндотелиальных клеток продолжительного действия [ Heath W.F. et al., 1989 ].
В механизме проведения митогенного сигнала значительная роль принадлежит инозит-содержащим фосфолипидам: фосфатидилинозитдифосфату (ФИР2) , фосфатидилинозитфосфату (ФИР) и фосфатидилинозиту (ФИ) . В плазматических мембранах, выделенных из интактных ВАСЕ-клеток, предварительно обработанных АНГ, по мере повышения дозы АНГ, в сущности, происходит прогрессивное снижение синтеза ФИР2 из экзогенного лизофосфатидилинозита и арахидоната. При концентрации АНГ 100 нг/мл синтез составляет не более 5% от контрольных значений [ Heath W.F. et al., 1989 ] ( рис. 8б ). При этом КоА-синтаза жирных кислот , необходимая для синтеза ФИР2, в ВАСЕ-клетках под воздействием АНГ, не активируется [ Heath W.F. et al., 1989 ]. В эндотелиальных клетках легочной артерии теленка (СРАЕ) , пупочной вены человека (HUVE) и капилляров коры надпочечников быка (ВАСЕ) АНГ активирует инозит- специфическую фосфолипазу С : в результате гидролиза ФИР2 и ФИ наблюдается кратковременное повышение уровней 1,2- диацилглицерина (ДАГ) и инозитфосфатов [ Curran T.P. et al., 1993 ]. В СРАЕ-клетках АНГ при концентрации 1 нг/мл стимулирует образование ДАГ. Максимальные значения (увеличение в 1.6 раза) регистрируются через 2.5 мин. Через 20 мин отмечается возвращение к норме. Динамика образования ДАГ при стимуляции более высокими концентрациями АНГ (500 нг/мл) такая же, однако уровни реакции - в 10 раз ниже [ Bicknell R., Vallee B.L., 1988 ].
Порог АНГ-индуцированного образования ДАГ в СРАЕ-клетках - 0.01 нг/мл, максимальный ответ регистрируется при концентрации 1 нг/мл, слабый - уже при концентрациях, превышающих 100 нг/мл [ Bicknell R., Vallee B.L., 1988 ] ( рис. 9а ). В различных конфлюэнтных культурах эндотелиальных клеток порог индукции 'ДАГ одинаков: 0.001-0.01 нг/мл. Однако максимальное образование ДАГ отмечается при различных концентрациях АНГ: в ВАСЕ-клетках - при 0.1 нг/мл, в СРАЕ-клетках - при 1 нг/мл, в HUVE-клетках - при 100-1000 нг/мл [ Bicknell R., Vallee B.L., 1988 ] ( рис. 9а , рис. 9б , рис. 9в ). То есть, АНГ в концентрациях, сравнимых с его концентрацией в нормальной плазме человека (250-360 нг/мл) [ Blaser J. et al., 1993 , Shimoyama S. et al., 1996 ], вызывает незначительное повышение внутриклеточных уровней ДАГ в СРАЕ-клетках, тогда как в HUVE-клетках тенденция к снижению образования ДАГ не просматривается вплоть до концентрации 1 мкг/мл [ Bicknell R., Vallee B.L., 1988 ]. АНГ стимулирует в эндотелиальных клетках кратковременное выделение инозитфосфатов. Так, при экспозиции ВАСЕ-клеток с АНГ (0.1 нг/мл) на 15-й с обнаруживается 20%-й подъем внутриклеточных уровней инозин- 1,4,5-трифосфата (ИР2). Возвращение к значениям, характерным для состояния покоя, происходит через 2.5 мин.
Подъем уровня ИРз сопровождается повышением уровней инозиндифосфата (ИРз) - пик на 30-й с, и инозинмонофосфата (ИР) - пик через 1 мин. При этом уровни ИР сохраняются довольно высокими, по крайней мере, в течение 10 мин [ Bicknell R., Vallee B.L., 1988 ].
Постулируется, что ИРз мобилизует кальций из запасов эндоплазматического ретикулума [ Berridge M.J., Irvine R.F., 1984 ], однако АНГ-индуцированный поток кальция в монослое ВАСЕ-клеток не обнаружен [ Bicknell R., Vallee B.L., 1988 ]. Агонист эндотелиальных клеток - брадикинин - вызывает 5-кратное повышение ИРз [ Lambert T.L. et al., 1986 ]. Поэтому 20%-ное увеличение уровней ИРз под воздействием АНГ, вероятно, следует рассматривать как достаточное для того, чтобы индуцировать поток кальция.
СРАЕ- и ВАСЕ-клетки фактически не реагируют в конфлюэнтных культурах на присутствие АНГ в концентрациях, сравнимых с его концентрацией в сыворотке, и ДАГ не образуется. Поэтому можно допустить, что in vivo такой реакции со стороны эндотелия сосудов также не будет. Значение стимуляции образования ДАГ в конфлюэнтных СРАЕ- и ВАСЕ-клетках в присутствии АНГ в низких дозах неясно. С одной стороны, ДАГ активирует протеинкиназу С (ПКС) , что коррелирует с экспрессией гена с-mус , однако активации ПКС и экспрессии с-тус недостаточно для проявления митогенного эффекта, связанного с активацией фосфолипазы С [ Coughlin S.R. et al., 1985 ]. Значительное повышение внутриклеточного уровня кальция , обусловленное IP3 , является сигналом к клеточному росту. АНГ же индуцирует лишь весьма незначительное повышение кальция (20%), что, видимо, отражает неспособность АНГ в низких концентрациях стимулировать рост конфлюэнтных эндотелиальных клеток посредством активации фосфолипазы С.
