Антагонисты ангиогенина: угнетение роста опухолей
Ангиогенез играет значительную роль в росте опухолей. Развитие опухолей обусловлено тем, что они выделяют ангиогенные факторы, способствующие неоваскуляризации, а следовательно, снабжению опухоли кислородом, питательными веществами и факторами роста.
Противораковая терапия направлена, главным образом, на подавление роста опухолевых клеток и усиление иммунного ответа хозяина. Но возможен и третий путь - подавление сосудистой системы [ Moore J.V., West D.С., 1991 ].
В отсутствие кровоснабжения опухоль не только прекращает рост, но и теряет возможность выделять опухолевые клетки в кровь, а следовательно, индуцировать метастазы. АНГ играет важную роль в образовании опухолей НТ-29 у бестимусных мышей. Нецитотоксические АНГ-нейтрализующие моноклональные антитела (мАТ) 26-2F значительно снижают, а в некоторых случаях - полностью подавляют образование опухолей клетками НТ-29. Эффект наблюдается при использовании мАТ в дозах, незначительно (в 2-5 раз) превышающих пороговые. Пороговые же дозы повышаются с увеличением числа вводимых опухолевых клеток: 3 мкг для 5 х 105# и 6 мкг для 1 х 106# клеток (ежедневно, в течение 14 дней). При этом более значительное повышение пороговых доз (в 10-50 раз) не сопровождается дальнейшим усилением терапевтического эффекта. Он сохраняется на прежнем уровне: 10-25% мышей без опухолей (в контроле - опухоли у 100% мышей) [ Olson К.А. et al., 1994 ]. Однако у животных, получивших всего лишь 1.25 х 105# опухолевых клеток, максимальный терапевтический эффект (65% мышей без опухолей) отмечается при ежедневном введении (в течение 35 дней) 60 мкг мАТ [ Olson K.A. et al., 1995 ].
Моноклональные антитела 26-2F (IgGlk) представляют собой высоко специфический ингибитор АНГ человека. Они снижают образование опухолей из трансформированных клеток у бестимусных мышей, подавляют АНГ-индуцированный ангиогенез на ХАО , нейтрализуют рибонуклеазную активность АНГ в системе белкового синтеза in vitro, отменяют расщепление ангиогенином тРНК. Сайт, распознаваемый мАТ 26-2F в молекуле АНГ, представлен Тгр- 89 и сегментом 38-41. Этот эпитоп формируется двумя расположенными по соседству петлями (2 и 7), содержащими остатки 34-40 и 85-92 соответственно [ Fett J.W. et al., 1994 ] ( рис. 2 ).
Другие АНГ-нейтрализующие мАТ, З6u , также препятствуют подавлению опухолей НТ-29. В опухолях мышей, получивших мАТ 26- 2F или З6u, снижена плотность сосудов. Эти данные подтверждают гипотезу о том, что противоопухолевый эффект мАТ 26-2F и З6u обусловлен угнетением опухоль-индуцированного ангиогенеза [ Olson K.A. et al., 1995 ]. Антитела мАТ 26-2F также препятствуют росту опухолей А549 (клетки легочной аденокарциномы) и НТ-1080 (клетки фибросаркомы) , антитела Зби подавляют рост опухоли А549 (клетки НТ-1080 не тестировались). Обе линии опухолевых клеток секретируют АНГ [ Fett J.W. et al., 1994 ].
Антагонист АНГ - актин - по своей способности подавлять образование опухолей напоминает мАТ. Ежедневное введение в течение 35 дней 18 мкг актина (молярный эквивалент 60 мкг мАТ) полностью подавляет опухолевый рост у 63% мышей, получивших 1.25 х 105 клеток НТ-29 [ Fett J.W. et al., 1994 ].
Актин и антиактиновые антитела угнетают АНГ-индуцированный ангиогенез на ХАО [ Hu G.-F. et al., 1993 ]. В присутствии актина (1-10 мкг/мл), мАТ к альфа-актину гладких мышц (100 мкг/мл) отмечается подавление интернализации АНГ (100 нг/мл) в пролиферирующих СРАЕ-клетках [ Moroianu J., Riordan J.F., 1994 ]. В отличие от мАТ, актин связывается с АНГ мышей. Тем не менее, ежедневное введение актина в дозах, в 50 раз (и более) превышающих молярное количество АНГ, циркулирующего у мышей (около 7 пмоль), не вызывает побочных токсических эффектов. Тем не менее, возможность нейтрализации АНГ человека актином все же существует [ Fett J.W. et al., 1994 ].
Приведенные данные свидетельствуют о том, что актин и его аналоги представляют собой перспективный класс ингибиторов АНГ.
На основе фагового клона, специфически связывающегося с рецептор-связывающим сайтом АНГ, синтезирован пептидный антагонист чАНГ - ANI-E . В отличие от мАТ и актина, ANI-E не создает иммунологических проблем и не вызывает обструкцию вен в легких [ Lee W.M., Galbraith P.M., 1992 ].
В качестве ингибиторов АНГ, ангиогенеза и роста опухолей могут, по всей вероятности, выступать белковые ингибиторы панкреатических и родственных им РНКаз, обнаруживаемые в цитоплазме различных клеток млекопитающих. Очищенные препараты таких ингибиторов из плаценты человека [ Blackburn P. et al., 1977 ], мозга быка [ Burton L.E. et al., 1980 ], щитовидной железы и печени свиньи [ Turner P.M. et al., 1993 ] эффективно ингибируют РНКазу А. Из этой серии белков наиболее хорошо изучен плацентарный ингибитор рибонуклеазы (ПИР) . Этот белок (мол. масса 48 кДа) обнаруживается во многих тканях [ Aoki Y., Natori S., 1981 ]. Стехиометрически и с высоким сродством он связывается с РНКазой А [ Blackburn P. et al., 1977 ]. Повышение его уровней предшествует накоплению РНК в активно делящихся клетках и, напротив, снижение активности ПИР и одновременное повышение РНКазной активности отмечается в период катаболизма [ Kraft N., Shortman К., 1970 ].
ПИР является мощным антагонистом рибонуклеазной и ангиогенной активности АНГ. Его добавление в незначительном молярном избытке полностью подавляет расщепление 28S и 18S рРНК. Смешанный в избытке с АНГ (до тестирования), он полностью подавляет неоваскуляризацию на ХАО [ Shapiro R., Vallee B.L., 1987 ]. Его связывание с АНГ в 100 раз более эффективно, чем с другими РНКазами [ Fox E.A., Riordan J.F., 1990 ]. ПИР обнаруживается в нормальной сыворотке крови в концентрациях 200-300 нг/мл, АНГ - в концентрациях 250-360 нг/мл. Это свидетельствует о приблизительно одинаковых молярных концентрациях указанных белков в сыворотке [ Shapiro R., Vallee B.L., 1987 , Blaser J. et al., 1993 , Shimoyama S. et al., 1996 , Feldman M. et al., 1988 ]. Высокое сродство ПИР по отношению к АНГ, обнаружение обоих белков в различных тканях, но главным образом - в печени [ Weiner H.L. et al., 1987 , Aoki Y., Natori S., 1981 ], свидетельствует о возможности функционирования ПИР в качестве физиологического ингибитора АНГ. Сайт, распознаваемый ПИР в молекуле АНГ, отличается от сайта, узнаваемого антителами мАТ. ПИР, кроме Тгр-89 и Lys-40, взаимодействует также с Arg-5, Arg-32 и His-114 [ Fett J.W. et al., 1994 ]. Вполне возможно, что ПИР представляет собой достаточно мощный ингибитор роста АНГ-секретирующих опухолей. Интересно, что в эритроцитах, тромбоцитах, мононуклеарных лейкоцитах и гранулоцитах обнаружены ингибиторы РНКаз со свойствами, сходными с ПИР, особенно - в зрелых эритроцитах, лишенных ядра и метаболизма РНК [ Nadano D. et al., 1995 ]. Интересно, что в данном исследовании ПИР в образцах плазмы отсутствует. Не исключено, что активность АНГ в плазме регулируется ингибиторами РНКаз клеточных элементов крови.
В качестве специфических антагонистов АНГ и ингибиторов роста АНГ-секретирующих опухолей, вероятно, могут выступать и мутанты АНГ по каталитическому сайту: HIЗА , Н114А , H114N и K40Q , не обладающие ни РНКазной, ни ангиогенной активностями. Наличие интактного сайта связывания с клеткой позволяет им конкурировать с нативным белком за рецептор клеточной поверхности и ингибировать АНГ-индуцированный ангиогенез [ Shapiro R., Vallee B.L., 1989 ]. Для транслокации к ядру АНГ должен обладать сигналом ядерной локализации - полипептидом 31RRRGL35 с критическим остатком R33. Поэтому неангиогенный мутант R33A с интактным сайтом связывания с клеткой [ Shapiro R., Vallee B.L., 1992 ] может также рассматриваться как конкурент АНГ. Ядерную транслокацию чАНГ в эндотелиальных клетках, АНГ-индуцированную пролиферацию человеческих эндотелиальных клеток и АНГ-индуцированный ангиогенез на ХАО ингибирует аминогликозидный антибиотик неомицин ( табл. 5 ). На базальный уровень пролиферации и жизнеспособность эндотелиальных клеток указанный антибиотик влияния не оказывает [ Hu G.-F., 1998 ]. Неомицин и его аналоги весьма перспективны для антиангиогениновой терапии. Другие аминогликозидные антибиотики (гентамицин, стрептомицин, канамицин, амикацин и паромомицин) на АНГ-индуцированную пролиферацию эндотелиальных клеток не действуют.
