Ангиогенин: торможение синтеза белка, расщепление рРНК
Аминокислотные последовательности АНГ и панкреатической РНКазы А обладают 33%-ной гомологией, АНГ содержит три остатка активного центра РНКазы: His-12, Lys-41 и His-119. Однако АНГ, в отличие от РНКазы, не активен в отношении поли(С), поли(U), циклического цитидин2',.З'-фосфата, циклического уридин-2',3'- фосфата, РНК пшеничных зерен, а также по отношению к гибридам РНК-ДНК, двухцепочечным полирибонуклеотидам, 2',5'-связанным динуклеотидам [ Shapiro R. et al., 1986 ].
АНГ - весьма специфическая рибонуклеаза, расщепляющая РНК в меньшем числе сайтов, чем панкреатические РНКазы, поэтому кислотонерастворимые продукты эндонуклеазной активности АНГ не могут быть обнаружены методами, используемыми для панкреатических РНКаз [ Shapiro R. et al., 1986 ]. При изучении влияния АНГ на препарат РНК из опухолевых эпителиальных клеток аденокарциномы толстой кишки человека НТ-29 , состоящий из 28S и 18S рРНК (около 5000 и около 2000 н. соответственно), с помощью электрофореза в агарозном геле обнаружено, что АНГ действительно расщепляет рРНК. Основные продукты деградации, состоящие из 100-500 н., образуются через 60 мин, и более глубокий гидролиз с увеличением времени инкубации (до 255 мин) не происходит. В аналогичных условиях РНКаза генерирует мелкие фрагменты, мигрирующие впереди фронта красителя. Для получения такой же степени деградации рРНК требуется примерно в 105# раз больше АНГ, чем РНКазы (1.9 мкМ и 0.13 нМ соответственно) [ Shapiro R. et al., 1986 ].
Предполагают [ St. Clair O.K. et al., 1987 ], что различная глубина расщепления РНК ангиогенином и РНКазой может быть причиной различий в их биологической активности. Действительно, АНГ полностью подавляет синтез белка в системе лизата кроличьих ретикулоцитов в концентрациях, при которых РНКаза вызывает лишь частичное ингибирование [ St. Clair O.K. et al., 1987 ].
Торможение бесклеточного синтеза белка ангиогенином обусловлено именно специфическим расщеплением рРНК под его влиянием: плацентарный ингибитор РНКазы снимает угнетение белкового синтеза ангиогенином, и при повторном добавлении интактных рибосом к лизату, обработанному АНГ, синтез белка восстанавливается [ St. Clair O.K. et al., 1987 ]. Подавление синтеза белка в присутствии АНГ происходит через 20 мин после его добавления в среду (конечная концентрация 40 нМ). Подобно пуромицину, АНГ является ингибитором элонгации трансляции. Торможение белкового синтеза при низкой концентрации АНГ (40 нМ) можно объяснить тем, что инактивации небольшого числа рибосом достаточно для блокирования продвижения других рибосом вдоль полисомы [ St. Clair O.K. et al., 1988 ].
АНГ расщепляет рРНК в интактных рибосомах. На электрофореграммах РНК, выделенной из рибосом, обработанных АНГ при высоких концентрациях (0.1 мкМ/50 мкг рибосом), обнаруживаются фракции, движущиеся быстрее 28S и 18S рРНК [ St. Clair O.K. et al., 1988 ]. При продолжительном инкубировании (240 мин) рибосом с АНГ (0.7 мкг/5 мг) наблюдается уменьшение интенсивности полос 28S и 18S рРНК вплоть до их полного исчезновения, а также появление новой полосы, мигрирующей непосредственно впереди 18S рРНК. То есть 28S рРНК деградирует, превращаясь в продукт, несколько меньший, чем фрагмент 18S рРНК. Такая же картина расщепления наблюдается и при раздельной инкубации рибосомных субъединиц с АНГ, что свидетельствует о доступности чувствительных к АНГ участков в состоянии, когда рибосомные субъединицы связаны в составе полной рибосомы [ St. Clair O.K. et al., 1988 ].
Выделенные рибосомы, обработанные АНГ, в отличие от интактных, не способны к восстановлению трансляционной активности системы лизата кроличьих ретикулоцитов, причем потеря способности синтезировать белок обусловлена влиянием АНГ на 18S рРНК в составе 405-субъединицы, но не на 28S рРНК в составе 4ОS-субъединицы [ St. Clair O.K. et al., 1988 ]. Таким образом, действие АНГ на рРНК в составе рибосом отличается от его действия на выделенные 18S и 28S рРНК, которые расщепляются до фрагментов, содержащих 100-500 нуклеотидов [ Shapiro R. et al., 1986 ].
