Ангиогенин: транслокация в ядро
Митогенные и другие физиологические сигналы, индуцируемые ангиогенными факторами , передаются ядру с помощью вторичных посредников или при прямом поступлении факторов в ядро.
АНГ человека подвергается эндоцитозу пролиферирующими эндотелиальными клетками легочной артерии теленка (СРАЕ- клетками) , транспортируется к ядру и накапливается в ядрышках . В ядрах покоящихся конфлюэнтных (находящихся в стадии слияния) клеток АНГ не выявляется. Продвижение АНГ в пролиферирующих (1- дневных) СРАЕ-клетках прослежено с помощью иммунофлуоресцентного метода с использованием моноклональных антител (26-2F) к АНГ человека. АНГ в ядре обнаруживается через 30 мин после его добавления в среду для культивирования в концентрациях 1000 и 100 (но не 50 нг/мл.) Изучение динамики интернализации и транслокации АНГ показало, что его продвижение к ядру и ядрышку происходит достаточно быстро: после 5 мин инкубации АНГ обнаруживается, главным образом, в цитоплазме, спустя 15 мин - в ядре, а через 60 мин - в ядрышках [ Moroianu J., Riordan J.F., 1994 ]. В цитоплазме конфлюэнтных непролиферирующих СРАЕ-клеткок АНГ с трудом обнаруживается даже после 24 ч инкубирования. Интернализация и транслокация АНГ к ядрышку выявлена также и в растущих эндотелиальных клетках GM 7373 . В фибробластах BALB/c 3T3 указанные процессы не происходят.
Отсутствие транслокации АНГ к ядру в непролиферирующих конфлюэнтных эндотелиальных клетках свидетельствует о взаимосвязи между ядерной транслокацией АНГ и пролиферативным состоянием клетки. Предполагается, что на поверхности конфлюэнтных СРАЕ-клеток снижено число АНГ-связывающих сайтов или они отсутствуют вовсе [ Badet J. et al., 1989 ]. Регуляция численности рецепторов плотностью клеток обнаружена при изучении фактора роста нервов , фактора роста эпидермиса , фактора роста фибробластов , трансформирующего фактора роста бета , фактора роста тромбоцитов [ Badet J. et al., 1989 ]. Подавление интернализации АНГ при инкубировании СРАЕ-клеток с АНГ отмечается в присутствии актина , гепарина , а также моноклональных антител к АНГ (26-2F) и альфа-актину гладких мышц. Это свидетельствует о том, что в процесс интернализации, возможно, вовлечены АНГ-связывающий белок (актин) и гепарансульфатпротеогликаны [ Moroianu J., Riordan J.F., 1994 ]. За интернализацию и ядерную транслокацию АНГ в эндотелиальных клетках отвечает сайт связывания с клеткой, включающий, как минимум, остатки 60-68 [ Hallahan T.W. et al., 1991 ] и сегмент АНГ, содержащий Asn-109 [ Hallahan T.W. et al., 1992 ].
Эндоцитоз и ядерная транслокация необходимы для проявления ангиогенных свойств АНГ: ферментативно активный конкурент нативного АНГ за связывание с эндотелиальными клетками на ХАО - мутант N109D, не транспортирующийся к клеточному ядру, не обладает ангиогенной активностью. Каталитический сайт АНГ для транслокации не требуется: ферментативно неактивные мутанты K40Q и HI ЗА с интактным сайтом связывания с клеткой транспортируются к ядрышкам пролиферирующих СРАЕ-клеток, как и нативный АНГ.
Поскольку рибонуклеазная активность - определяющая для проявления ангиогенной активности АНГ, предполагается, что субстрат АНГ in vivo локализован в ядре и, по всей вероятности, в ядрышке, где происходит синтез и процессинг рРНК [ Moroianu J., Riordan J.F., 1994 ]. Белки, транспортирующиеся к ядрам эукариотических клеток, обладают специфическим сигналом ядерной локализации , содержащим обычно большую долю основных аминокислот [ Garcia-Bustos J. et al., 1991 ]. Для АНГ человека таким сигналом является пептид RRRGL , соответствующий аминокислотным остаткам 31-35. Этот пептид специфически направляет к ядру неядерные белки-носители, такие как альбумин , моноклональные антитела к ядрышкам и RЗЗА-АНГ . Белки, конъюгированные с мутантным пептидом RRRGL, в ядро не проникают. Таким образом, R33 представляет собой критически важный остаток для определения ядерной локализации, остатки R31 и R32 выступают лишь как модуляторы этого процесса [ Moroianu J., Riordan J.F., 1994 ]. Мутант R33A, не локализующийся в ядре, не обладает активностью ангиогенина. Это еще раз подтверждает необходимость локализации АНГ в ядре пролиферирующих эндотелиальных клеток для проявления его ангиогенной активности.
