YB1-Белок: регуляция ABC-транспортеров
Белок YB-1 млекопитающих является членом мультифункционального семейства ДНК/РНК-связывающих белков с эволюционно-консервативным доменом холодового шока [ Скабкин, 2004 ]. YB-1 - РНК-связывающий белок широкой специфичности, участвующий в регуляции транскрипции и трансляции мРНК, ее сплайсинга и обеспечения стабильности. В качестве фактора транскрипции он регулирует экспрессию генов, имеющих Y-боксы в промоторах и энхансерах (инвертированные последовательности ССAAТ). К таким генам принадлежит ген MDR1 , кодирующий Pgp .
В данных о регуляции MDR1 путем связывания YB-1 с Y-боксом имеются определенные противоречия [ Scotto, 2003 ]. Однако достаточно много работ свидетельствует о том, что YB-1 регулирует экспрессию гена MDR1 [ Bargou, 1997 , Ohga, 1998 , Oda, 2003 , Saji, 2003 ] и гена, кодирующего белок множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) - LRP [ Stein, 2005 ].
Целый ряд внешних воздействий, по-видимому, может способствовать функционированию YB-1 в качестве фактора транскрипции: перемещение YB-1 из цитоплазмы в ядра клеток наблюдалит после воздействия ДНК- повреждающих веществ, УФ-облучения, повышенной температуры [ Ohga, 1998 , Stein, 2001 ]. Перемещение YB-1 из цитоплазмы в ядра культивируемых клеток рака кишечника линий НСТ116 и НСТ15 приводило к активации генов, кодирующих Pgp и MRP1 , к увеличению экспрессии этих транспортеров клетками и к возрастанию их функциональной активности. Однако при этом лекарственная устойчивость не возникала [ Stein, 2001 ]. Ядерная локализация YB-1 коррелировала с экспрессией Pgp при раке молочной железы , остеосаркоме , раке легкого [ Bargou, 1997 , Saji, 2003 , Oda, 1998 , Shibahara, 2001 ].
Существуют тем не менее результаты, свидетельствующие в пользу того, что высокое содержание YB-1 в клетках может быть недостаточным для активации гена MDR1 при генотоксическом стрессе [ Hu, 2000 ]. Имеются данные и о том, что связь YB-1 и МЛУ зависит от клеточного контекста, т.е. от особенностей активности сигнальных путей данных клеток и тканей [ Shibao, 1999 ].
Таким образом, данные о связи YB-1 и МЛУ неоднозначны, требуются дополнительные исследования.
Один из первых вопросов этих исследований относился к изменениям экспрессии и внутриклеточной локализации YB-1 в лекарственно-устойчивых клетках. Систематического исследования этой проблемы не было. Поэтому было исследовано пять пар линий клеток опухолей человека, чувствительных (родительских) и резистентных к цитостатикам, и шестую резистентную линию клеток ( табл. 6 ) [ Вайман, 2006 , Liscovitch, 2007 , Twentyman, 1986 ]. С помощью полуколичественного метода ОТ-ПЦР (полимеразной цепной реакции с использованием обратной транскрипции) была исследована экспрессия генов, обусловливающих лекарственную устойчивость опухолевых клеток, а именно: MDR1 , MRP1 , BCRP , а также гена YB-1 . В половине резистентных вариантов повышенная экспрессия генов/белков множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) сопровождалась повышенной экспрессией гена/белка YB-1, в половине случаев такой корреляции не наблюдалось. Степень повышения количества мРНК YB-1 не коррелировала с уровнем лекарственной устойчивости резистентных клеток. Ясно, что увеличение количества мРНК YB-1 в резистентных клетках не является обязательным признаком лекарственной устойчивости, хотя обнаруживается достаточно часто. Следует отметить, что в резистентных клетках, где экспрессия гена YB-1 была наиболее выражена, было обнаружено повышение содержания мРНК сразу нескольких генов МЛУ ( табл. 6 ) [ Вайман, 2006 ].
Было также исследовано соотношение количества YB-1 в ядрах и цитоплазме чувствительных и резистентных клеток методом непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии. Анализ показал, что в двух из трех исследованных пар линий число клеток с ядерной локализацией YB-1 было повышено в резистентных клеточных популяциях по сравнению с таковым в исходных чувствительных клетках ( табл. 6 ) [ Вайман, 2006 ]. В популяции резистентных к адриабластину клеток NCl/ADR-RES число клеток с YB-1 в ядрах высокое (50%). Таким образом, изменения локализации YB-1 и повышение экспрессии кодирующего этот белок гена нередко сопутствуют МЛУ.
Еще одна нерешенная проблема - влияние YB-1 на ранние этапы возникновения множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Было показано, что повышение экспрессии YB-1 в клетках обеспечивает им селективное преимущество при размножении в среде с цитостатиками [ Вайман, 2007a ]. Эти эксперименты были проведены с использованием транзиторной трансфекции клеток НСТ116 и НЕК293 плазмидой, которая содержит полноразмерный ген YB-1, сшитый с геном флуоресцентного белка GFP . Это позволило проследить сохранение клеток с трансгеном после культивирования в среде с винбластином или цисплатином. Контролем служили клетки, трансфицированные плазмидой, содержавшей только ген белка GFP. Анализ проводился на проточном цитофлуориметре. Эксперименты показали, что через пять суток после трансфекции доля клеток с геном YB-1/GFP была в 1,5 раза выше, чем доля клеток с геном GFP, что свидетельствует о селективном преимуществе клеток, трансфицированных геном YB-1, при размножении в среде с цитостатиком. Это косвенно может служить доказательством того, что повышение активности YB-1 способствует возникновению лекарственной устойчивости популяций клеток опухолей, и позволяет полагать, что активность YB-1 необходима не для поддержания уже существующей лекарственной устойчивости, а в первую очередь, для формирования новых резистентных клеточных популяций, характеризующихся многофакторной МЛУ.
В пользу того что активность YB-1 и многофакторная МЛУ связаны, свидетельствуют результаты опытов, в которых количество мРНК YB-1 увеличивали в результате трансфекции гена YB-1 в клетки или снижали, вводя мшРНК-YB-1 [ Вайман, 2007a ]. На клетках НСТ116, NCl/ADR-RES и mS-0,5 методом ОТ-ПЦР было показано, что снижение экспрессии гена YB-1 под действием мшРНК-YB-1 влечет за собой снижение экспрессии разных генов МЛУ [ Вайман, 2007a , Вайман, 2007b ]. Изменение экспрессии гена YB-1 (повышение в результате трансдукции гена или снижение действием мшРНК) влияет на пролиферацию клеток. Клетки НСТ116 с трансгеном YB-1/GFP размножались быстрее, чем контрольные клетки с трансгеном GFP. Клетки КВЗ-1, обработанные мшРНК YB-1, размножались медленнее, чем контрольные клетки. Можно полагать, что повышение экспрессии YB-1 в ответ на стрессовые воздействия, в том числе на действие химиопрепаратов, может вызывать повышение экспрессии некоторых белков МЛУ. При этом возникает пул клеток, обладающих селективными преимуществами при воздействии цитостатиками и характеризующихся ускоренным размножением. При повторном воздействии лекарств возникает популяция резистентных клеток (приведенные выше данные свидетельствуют о том, что после транзиторной трансфекции в клетки НСТ116 и НЕК93 гена YB-1/GFP в первые 2-5 суток эти клетки лучше выживали в среде с винбластином и цисплатином, чем клетки с GFP).
Таким образом, все представленные результаты анализа клеток с МЛУ, исследования влияния обработки клеток цитотоксическими веществами на экспрессию и локализацию YB-1, транзиторной трансфекции гена YB-1 в клетки, введения в клетки мшРНК YB-1 свидетельствуют о том, что YB-1 чаще всего влияет одновременно на экспрессию нескольких AВС- транспортеров. Набор этих белков зависит от вида клеток и воздействующих веществ. YB-1 может осуществлять регуляцию белков МЛУ как на транскрипционном уровне, так и в качестве фактора трансляции и, вероятно, с помощью других своих функций, т.е. влияние YB-1 на активность AВС-транспортеров связано, по-видимому, с разными активностями этого белка.
