Мультилекарственные транспортеры: узнавание субстратов
Хотя трансфекция генов в клетки - достаточно искусственная модель, результаты таких опытов свидетельствуют в пользу того, что существуют ситуации, в которых один и тот же белок может выполнять не свойственные ему физиологические функции и осуществлять защиту клеток от лекарств. Было бы очень интересно понять, действительно ли происходит такое переключение и, если да, то как оно осуществдяется. Для того, чтобы приблизиться к этому пониманию, рассмотрим сведения о том, как мультилекарственные транспортеры (МЛТ) узнают свои субстраты.
Большое количество разнообразных субстратов, которые могут связывать такие МЛТ, как Pgp или MRP1 , долгое время вызывало удивление исследователей. Было показано, например, что Pgp транспортирует сотни лекарств, пептидов, некоторые липиды [ Ambudkar, 1999 ]. Классические исследования большого числа ферментов показали, что связывание фермента с субстратом осуществляется благодаря ряду специфических атомарных взаимодействий между аминокислотными остатками фермента и молекулой субстрата. Не удивительно, что сама мысль о том, что связывающий сайт МЛТ может взаимодействовать с десятками не сходных по структуре молекул, воспринималась многими как нарушение основных законов биохимии.
Достижения в структурном анализе МЛТ и некоторых других белков, распознающих множество веществ, позволило разгадать загадку. Очень большой вклад в решение этой проблемы был внесен А.А.Нейфахом мл. [ Higgins, 2007 , Нейфах, 2003 , Neyfakh, 2002 ]. Для Pgp были опубликованы первые результаты структурного анализа, полученные, к сожалению, при невысоком разрешении [ Rosenberg, 2001 ]. Появились результаты исследования структуры бактериального гомолога Pgp MsbA , который участвует в трансмембранном транспорте липида A, необходимого для формирования оболочки бактерии [ Higgins, 2007 ].
Сопоставление ABC-белков, принадлежащих разным организмам, вполне правомерно - функциональная активность AВС-транспортеров человека и бактерий обеспечивается одним и тем же механизмом. Это ярко демонстрирует замечательная работа, в которой ген LmrA , кодирующий ABC- транспортер бактерии Lactococcus lactis (определяет резистентность бактерии к антибиотикам), ввели в клетки человека. В человеческих клетках белок LmrA встроился в плазматическую мембрану и стал обеспечивать лекарственную устойчивость этих клеток. Субстратная специфичность LmrA при этом совпадала с субстратной специфичностью Pgp [ van Veen, 1998 ].
К сожалению, и Pgp, и MsbA были гидрофобны, что затрудняло получение материала для изучения их структуры. Исследование растворимого белка BmrR , близкого к МЛТ, дало наиболее полные результаты [ Zheleznova, 1999 ].
BmrR - регулятор транскрипции Bmr, мультилекарственного транспортера В.subtilis. В ответ на связывание различных гидрофобных катионов он активирует экспрессию Bmr. Важно подчеркнуть, что была проанализирована структура этого белка не только в покое, но и в комплексах с субстратами. Результаты всех этих работ позволили построить модель перемещения AВС-транспортерами своих субстратов [ Нейфах, 2003 , Neyfakh, 2002 , Zheleznova, 1999 ].
Pgp включает в себя два TMD (трансмембранных домена) и два NBD (AТР-связывающих домена). Структурный анализ выявил внутри клеточной мембраны большую полость (карман), сформированную трансмембранными спиралями молекулы транспортера [ Zheleznova, 1999 ]. Этот карман имеет два боковых отверстия, обращенных внутрь пространства мембраны, через которые, по-видимому, субстраты могут войти в полость кармана. Ранее полученные данные свидетельствовали в пользу того, что субстраты выбрасываются транспортерами из пространства, ограниченного внутренним слоем мембраны, а не из цитозоля [ Higgins, 2007 , Нейфах, 2003 ]. Согласно предложенной модели, после связывания AТР с внутриклеточными NBD транспортера (Pgp), конформация трансмембранных спиралей белка сильно изменяется, в результате чего боковые отверстия закрываются [ Нейфах, 2003 , Zheleznova, 1999 ]. Этот процесс сопровождается, очевидно, снижением аффинности транспортера к субстрату, что приводит к диссоциации связанного субстрата во внеклеточную среду. Вслед за гидролизом AТР и диссоциацией ADP и фосфата молекула транспортера возвращается к исходной конформации, характеризующейся высокой аффинностью к субстратам.
Механизм связывания, как полагают, состоит в следующем: лиганды, проникающие в глубокий карман белка, устанавливают ван-дер-ваальсовы связи с окружающими гидрофобными остатками. Существенно, что размеры связывающего кармана достаточно велики для того, чтобы разные лигандные молекулы могли ориентироваться по-разному для взаимодействия с разными наборами остатков, формирующих стенки кармана [ Нейфах, 2003 ]. Поскольку структуры AВС-транспортеров человека в состоянии их связи с субстратами исследованы не были, эта модель пока носит для них гипотетический характер и исследования в этом направлении должны быть продолжены [ Higgins, 2007 ]. Тем не менее основные механизмы связывания субстратов AВС-транспортерами и сходными с ними белками стали ясными.
Предложенные принципы их функционирования объясняют многие загадки, в том числе и проблему переключения белков с их физиологической функции на функцию защиты. В этом отношении важно, что существуют работы свидетельствующие о том, что ABC-белки имеют несколько сайтов связывания лигандов [ Martin, 2000 , Shapiro, 1997 , Zelcer, 2003 ]).
