Na+,K+-АТФазы: чувствительные и не чувствительные к кардиогликозидам
Nа+,K+-АТФаза является единственной фармакологической мишенью для сердечных гликозидов (в том числе уабаина ), которые ингибируют фермент, стабилизируя его в функционально неактивной конформации [ AnnerB.M. ea 1985 ]. Чувствительность Na+,К+-АТФазы к ингибитору характеризуется тканевой и видовой изменчивостью [ Капля ea 1990 , Anner B.M. ea 1985 , Sweadner ea 1989 ]. Открытие у крыс a+ - и a1 форм каталитической субъединицы Na+,К+-АТФазы мозгового и почечного типов с разным сродством к уабаину дало основание высказать гипотезу об обусловленности межтканевых различий в чувствительности к кардиоактивным стероидам различиями в распределении разных форм АТФазы в тканях [ Sweadner ea 1979 ].
Данная гипотеза предполагает существование преимущества в функциональном ответе высокочувствительной к уабаину а+-формы на потенциальные эндогенные уабаин-подобные вещества [ Swann ea 1983 , Sweadner ea 1985 , Sweadner ea 1989 ], однако не объясняет причину межвидовых различий в сродстве к сердечным гликозидам для изоферментов одного типа [ AnnerB.M. ea 1985 , Periyasamy ea 1983 ].
Основываясь на корреляции параметров ннгибирования уабаином молекулярных форм Na+,К+-АТФазы в сердце собаки и хорька с фармакологической чувствительностью миокарда к кардиоактивным стероидам [ Maixent ea 1987 , Ng ea 1987 ], авторы использовали данную гипотезу для конкретизации механизма инотропного действия сердечных гликозидов [ Akera ea 1978 ]. Было высказано предположение [ Maixent ea 1987 ], что рецепторные свойства разных форм Na+,K+-ATфазы определяют физиологический ответ миокарда на действие сердечных гликозидов: молекулярная форма с высоким сродством к уабаину (а+) обеспечивает положительное инотропное действие на миокард, в то время как форма с более низким сродством к ингибитору (al) ответственна за их токсический эффект.
Однако сравнительный анализ индивидуальной чувствительности изоформ Nа+,К+-АТФазы мозга и почек к уабаину у разных видов животных, в частности в наших исследованиях, свидетельствует о том, что различия в чувствительности к сердечным гликозидам не являются общевидовым критерием для их идентификации (за исключением грызунов) [ Капля ea 1992 , Капля ea 1994 ]. Очевидно, иные функциональные свойства обусловливают физиологическую специфику изоферментов Na+,K+-АТФазы [ Капля ea 1997 ].
Показано, что а+-форма Na+,K+-АТФазы во всех случаях высокочувствительна к сердечным гликозидам и имеет сходное сродство к уабаину в препаратах из мозга всех исследованных видов животных, в том числе быка, кролика, крысы: в зависимости от лигандов, присутствующих при связывании ингибитора [ Болдырев ea 1985 ], Ki, для уабаина составляет -10#-7 М (+Mg:+, АТФ, Na+,K+) и ~10#-8 М +Mg2+, АТФ, Na+) [ Капля ea 1992 , Капля ea 1994 ]. Истинные изоферменты Na+,К+-АТФазы a2 и aЗ [ Sweadner ea 1989 ] характеризуются высокой чувствительностью к сердечным гликозидам [ Hara ea 1988 , Hsu ea 1989 , Kolansky ea 1992 , Peng ea 1992 , Urayama ea 1988 ]. Однако кинетика связывания уабаина с этими изоформами трудно дифференцируема, так как имеет место их коэкспрессия в тканях [ Sweadner ea 1989 ]. Имевшиеся в этом отношении попытки позволили разделить высокоаффинный к уабаину компонент активности Ка+,К+-АТФазы мозга на две составляющие и кинетически охарактеризовать две субпопуляции центров связывания с высоким сродством к ингибитору [ Berrebi-Bertrand ea 1990 , Blanco ea 1990 ]. Корректное определение параметров связывания уабаина стало возможным лишь в конце 90-х г в условиях раздельной экспрессии а2- и аЗ-изоформ в реципиентных клетках с эндогенной Na+,К+-АТФазой (al), имеющей низкое сродство к ингибитору.
Установлен следующий порядок сродства к уабаину изоформ Nа+,К+-АТФазы крысы: aЗ > a2 > a1 [ O'Brien ea 1994 ].
Для a1-изоформы Nа+,К+-АТФазы показана значительная межвидовая гетерогенность чувствительности к ингибитору. Сродство к уабаину оказалось единственной кинетической характеристикой, определяющей видовые различия a1-изоформы гликозидустойчивых и гликозидчувствительных типов фермента [ Periyasamy ea 1983 ].
Так, значения Ki для ингибирования a1-изоформы Nа+,К+-ATФaзы уабаином к присутствии К+ составляют ~10-7 и ~10-4 M для тканей быка, (свиньи), кролика и крысы, соответственно. В присутствии Na+, АТФ, Mg2+, стабилизирующих конформацию Nа+,К+-АТФазы Е2-Р (с которой уабаин связывается с наибольшей скоростью) [ Болдырев ea 1985 ], величина Кi гликозидчувствительных форм фермента уменьшается до 10-8 M, у резистентных к ингибитору форм остается без изменения [ Капля ea 1992 , Капля ea 1994 , Sweadner ea 1989 , Urayama ea 1979 ].
Как оказалось, видовые различия в сродстве к сердечным гликозидам являются следствием различий скоростей диссоциации фермент-ингибиторных комплексов, в то время как скорости ассоциации [3H]уабаина с формами Nа+,К+-АТФазы, обладающими разной чувствительностью к кардиоактивным стероидам, одинаковы [ Akera ea 1978 , O'Brien ea 1994 , Thomas ea 1989 , Tobin ea 1972 , Wallick ea 1980 , Yoda ea 1974 ].
Кроме того, установлены иммунологические различия между a1-изоформами каталитической субъединицы Nа+,К+-АТФазы с противоположным типом чувствительности к ингибитору [ Ball ea 1986 ]. Приведенные результаты легли в основу гипотезы о том, что характер чувствительности Nа+,К+-АТФазы к кардиоактивным стероидам реализуется на уровне уабаинсвязывающих участков фермента [ Periyasamy ea 1983 ].
Обнаружение эндогенных уабаин-подобных веществ, вырабатываемых в коре надпочечников [ Doris ea 1994 ], предполагает существование физиологических механизмов регуляции сократительной деятельности миокарда путем частичного ингибирования Na+,К+-АТФазы, а следовательно, и физиологическую детерминированность наличия рецептора сердечных гликозидов на молекуле фермента.
Высказано мнение, что дивергенция изоферментов Ка+,К+-АТФазы, обеспечивающих специфические потребности тканей в регуляции ионного транспорта, произошла на ранних этапах эволюции. Выявлена 85-86%-ная гомология аминокислотных последовательностей a1, а2, аЗ), в то время как формирование рецепторных форм a1-субъединицы (97%-ная идентичность) [ Sweadner ea 1989 ] связано, очевидно, с адаптационными потребностями внутри класса млекопитающих. Известно, что только ингибирование Na+-насоса сарколеммы миокарда в пределах резервной емкости (20-40%) обеспечивает положительное инотропное действие кардиоактивных стероидов на сердечную мышцу; превышение этого уровня ингибирования приводит к токсическому аритмогенному эффекту [ Akera ea 1991 ]. У уабаинчувствительных форм Ка+,К+-АТФазы сродство к ингибитору находится в физиологических пределах его концентраций, а содержание а+-формы фермента в сарколемме миокарда не менее 50% [ Maixent ea 1987 , Ng ea 1987 , Sweadner ea 1989 ]. В то же время только у грызунов присутствует уникальный резистентный фенотип al-изоформы и содержание ее в сарколемме взрослых крыс не менее 80% [ Sweadner ea 1989 ]. Это создает возможность регуляции сократительной деятельности миокарда на фоне высокой стабильности электрофизиологических процессов, обеспечиваемой резистентной a1-изоформой. что может являться одной из причин высокой экологической пластичности и толерантности этой группы млекопитающих к стрессовым воздействиям.
Следовательно, проблема существования физиологически обусловленных различий в чувствительности к ингибитору изоферментов Na+,К+-АТФазы заключается в адаптационной значимости разнообразия сродства к сердечным гликозидам рецептора этих высокотоксичных веществ, т.е. проблема сводится к молекулярным основам устойчивости к токсинам.
