Na+,К+-АТФаза (ATPаза): какие аминокислоты взаимодействуют с кардиогликозидами
Вопрос в том, какие конкретно аминокислоты, определяющие чувствительность к уабаину , непосредственно взаимодействуют с ингибитором, а какие опосредованно модулируют эффект ингибирования. Снижение сродства к уабаину может быть также косвенным результатом конформационных изменений в мутантной молекуле вследствие аллостерических взаимодействий [ Lingrel ea 1994 ].
Имеются сведения, что моноклональные антитела, эпитопы которых локализованы на эктодоменах Н1-Н2 и НЗ-Н4, не препятствуют связыванию уабаина с ферментом [ Arystarkhora ea 1992 , Satoh ea 1989 ]. Кроме того, единичные замены Цис-104 - Фен, Глн-111- Apr, Асп-121- Глу и Асн-122 - Асп сопровождаются лишь незначительным (в пределах одного порядка) уменьшением сродства к уабаину у мутантного фермента [ O'Brien ea 1993 , Price ea 1990 ].
Сходство скоростей связывания уабаина с молекулярными формами Na+,К+-АТФазы, обладающими разной чувствительностью к ингибитору, а также экспериментальное доказательство связывания уабаина также с резистентной a1-изоформой Ка+,К+-АТФазы крысы, сопровождающегося полным ингибированием ее активности [ O'Brien ea 1994 , Wallick ea 1980 ], позволили постулировать по крайней мере частичную консервативность участка связывания сердечных гликозидов у чувствительных и резистентных к ингибитору форм фермента [ Sthullheis ea 1993 ].
Поэтому поиск конкретных аминокислот, участвующих в связывании уабаина, в дальнейшем был направлен на выявление консервативных аминокислот в а-субъединице Nа+,К+-АТФазы с разным типом чувствительности к кардиоактивным стероидам. Замена таких аминокислот в ферменте овцы сопровождалась уменьшением скорости связывания ингибитора с мутантным ферментом [ SchuMieis ea 1993 ].
В этих исследованиях мутантные ферменты экспрессировали в клеточной линии мыши, что позволяло корректно определять константы скоростей связывания [3Н]уабаина с модифицированным ферментом на фоне эндогенной a1-изоформы Ка+,К+-АТФазы грызунов с низким сродством к уабаину. Уменьшение сродства к уабаину при замене консервативных аминокислот Цис-104 - Ала или Тир-108 - Ала обусловливалось увеличением только скорости диссоциации, при замене Про-118 - Лиз происходило также снижение и скорости ассоциации ингибитора с ферментом. Эти результаты служат подтверждением гипотезы, что домен Н1-Н2 может участвовать в непосредственном связывании уабаина на начальном этапе и, кроме того, претерпевать конформационные изменения с образованием стабильного фермент-ингибиторного комплекса [ Sthultheis ea 1993 ]. В то же время авторы не исключали возможности участия в связывании ингибитора также Цнс-104 и Тир-108. При замене Цис-113 - Фен в а-субъединице Na+,K+-АТФазы собаки уменьшение сродства мутантного фермента к уабаину обусловливалось одновременным уменьшением скорости связывания и увеличением скорости диссоциации ингибитора [ Canessa ea 1992 ].
Обнаружение внутримембранных аминокислот Цис-104 и Тир-108 в сегменте Н1 как детерминант чувствительности Na+,K+-АТФазы к уабаину не было неожиданным. Амфипатическая природа сердечных гликозидов предполагает частичную гидрофобность рецептора, не исключающую возможность взаимодействия липофильной стероидной части с внутримембранными аминокислотами при частичном проникновении ингибитора в бислой [ Burns ea 1993 ].
