Кардиогликозиды: ингибирование Na+,K+-АТФазы зависит от их гидрофобности
Известно, что ингибиторная способность синтетических аналогов кардиоактивных стероидов определяется не только структурой, но и характером распределения гидрофильных и гидрофобных областей в стероидной молекуле [ Kamernitzky ea 1989 ]. Ранние исследования с флуоресцентным зондом антроилуабаином свидетельствуют, что часть участка связывания гликозида гидрофобна и/или экранирована от водной фазы [ Fortes ea 1977 ]. Показано, что фотоаффинному мечению в ряде случаев могут подвергаться и фосфолипиды [ Модянов ea 1988 ]. Это предполагает, что гидрофобные сердечные гликозиды могут проникать в мембранный матрикс [ Lingrel ea 1994 ], однако неглубоко, так как мешают гидрофильные части молекулы: лактонное кольцо и остатки сахара [ Sthultheis ea 1993 ].
Структурно-ингибиторный анализ [ Thomas ea 1989 ], а также данные о том, что специфичные к эктодоменам антитела не препятствуют связыванию уабаина с ферментом [ Arystarkhora ea 1992 , Satoh ea 1989 ], позволили заключить, что часть рецептора сердечных гликозидов находится внутри свободной от воды щели, возможно образованной трансмембранными сегментами HI и Н2 а-субъединицы Nа+,К+-АТФазы.
Только замены Цис в cегменте HI al-изофор-мы Na+,К+-АТФазы, приводящие к утрате способности образовывать водородные связи со структурными компонентами молекулы сердечных гликозидов (на Ала, Тир, Фен), формировали резистентность к уабаину [ Canessa ea 1992 , Schultheis ea 1993 ].
Изостерическая замена на Сер (сульфгидрильной группы на гидроксильную; сохранялась способность к образованию Н-связей) не изменяла сродство к ингибитору мутантного фермента по сравнению с нативным [ Schultheis ea 1993 ].
Эти результаты (учитывая высокую способность Цис к образованию водородных связей [ Gregoret ea 1991 ] и данные структурно-ингибиторного анализа [ Naidoo ea 1974 ] дали основание для предположения, что Цис-104 с помощью водородной связи непосредственно вовлечен во взаимодействие с сердечными гликозидами [ Lingrel ea 1994 ], а именно с консервативным гидроксилом в положении С-14 стероидного ядра молекулы [ Askew ea 1994 ].
Кроме того, замены Цис-104 (Цис-108 в al Nа+,К+-АТФазы человека) на Ала, Фен или Тир специфически формируют дискретность в сродстве к дигоксину и дигитоксину - сердечным гликозидам, отличающимся один от другого только наличием гидроксильной группы в положении С-12 стероидной части молекулы [ Askew ea 1994 ]. Гипотеза, объясняющая феномен дискретности сродства этих гликозидов у мутантного фермента, предполагает устранение универсальной Н-связи с участием гидроксила в положении С-14 стероидного ядра, приводящее к неспецифпческому снижению сродства к сердечным гликозидам, возможную переориентацию лиганда (предположительно -стероидной части молекулы) в участке связывания и формирование новой Н-связи между гидроксильной группой дигоксина в положении С-12 и неидентифицированной аминокислотой, специфически обеспечивающей более высокую стабильность лиганд-рецепторного комплекса по сравнению с дигнтоксином [ Askew ea 1994 ].
В этих исследованиях не исключена, однако, возможность влияния стерических эффектов на чувствительность к уабаину мутантных форм Nа+,К+-АТФазы, поскольку наблюдается значительное расхождение в эффективности замен Цис на Ала (стерически консервативная аминокислота) и Фен (величина Кi, возрастала в 9 и 150 раз соответственно по сравнению с AT, эндогенной Na+,K+-ATФазы), которое может рассматриваться как результат возможных стерических препятствий, создаваемых аминокислотой с массивной боковой цепью, при взаимодействии ингибитора с участком связывания [ Schultheis ea 1993 ].
Сходные закономерности выявлены также и при формировании дискретности в чувствительности мутантного фермента к дигоксину и дигитоксину [ Askew ea 1994 ].
Для другой внутримембранной аминокислоты сегмента Н1 Тир-108 только замена на Ала, но не Фен (в обоих случаях устраняется гидроксильная группа, способная образовывать Н-связь) приводила к появлению резистентности Ка+,К+-АТФазы к уабаину. Очевидно, взаимодействие уабаина с Тир-108 опосредуется ван-дер-ваальсовыми силами, чувствительными к пространственным эффектам [ SchuMieis ea 1993 ].
При поиске аминокислот, влияющих на чувствительность к уабаину, в С-концевой области а-субъедницы Nа+ К+-АТФазы была применена следующая стратегия: с помощью случайного мутагенеза проводили замену многочисленных аминокислот в определенном локусе каталитической субъединпцы, выявляли резнстентные к уабаину клоны клеток, идентифицировали замещенные аминокислоты, перепроверяли влияние мутации конкретной аминокислоты в al-субъединице Nа+,К+-АТФазы на cродство фермента к уабаину [ Burns ea 1993 , Cantley ea 1994 , Feng ea 1994 , Sthullheis ea 1993 ].
Замена внутримембранной аминокислоты Тре-797, локализованной в непосредственной близости к поверхности мембраны [ Shull ea 1985 ] в предполагаемом трансмембранном сегменте Н5, на Асн в al-субъединице Na+,К+-АТФазы овцы (замена консервативна, обе аминокислоты полярны, не заряжены) формирует резистентность к уабаину у мутантного фермента, аналогичную таковой у a1-изоформы Ка+,К+-АТФазы крысы (Ki ~ 300 мкМ) [ Burns ea 1993 , Feng ea 1994 ]. Мутация этой аминокислоты с заменой на неполярную аминокислоту Иле продуцирует сверхрезистентный к уабаину фенотип Ка+,К+-АТФазы (Кi~ 5 мМ) [ Cantley ea 1994 ]. Замена Apr-880 на Про в эктодомене Н7-Н8 также формирует резидентный фенотип фермента с одновременным изменением скоростей ассоциации и диссоциации ингибитора [ Sthullheis ea 1993 ].
Как первый трансмембранный сегмент HI и первый эктодомен Н1-Н2 [ O'Brien ea 1993 ], так и Арг-880 С-концевого эктодомена Н7-Н8 [ Sthullheis ea 1993 ] не взаимодействуют с остатками сахара в молекуле кардиоактивных стероидов, на что указывают сохраняющиеся различия в сродстве к уабанину и уабагенину у мутантных ферментов.
Следует подчеркнуть, что единичные замены не обеспечивают полной резистентности фермента к уабаину. Это подтверждает современную концепцию о том, что участок связывания сердечных гликозидов комплексный и состоит из многочисленных функциональных групп на многих (если не всех) внеклеточных и внутримембранных доменах каталитической субъеднницы фермента [ Cantley ea 1994 , Lingrel ea 1994 ].
В связи с этим нужно отметить, что проявление сверхрезистентного к уабанну фенотипа Na+,K+-АТФазы в клоне клеточной линии почек собаки (Ki ~ 7 мМ) сопровождалось одновременной мутацией Цис в первом трансмембранном сегменте Н1 и Тир во втором эктодомене НЗ-Н4 [ Canessa ea 1992 , Canssa ea 1993 ].
Вероятно, что разнообразные домены способны в отдельности обеспечивать связывание уабаина, по крайней мере с низким сродством. Высокоаффинное связывание достигается лишь при одновременном участии различных доменов рецепторной части Nа+,К+-АТФазы [ Blostein ea 1993 ].
Кроме того, не исключена возможность взаимодействия отдельной структурной части молекулы сердечных гликозндов одновременно с различными (пространственно удаленными в условиях двухмерной модели) доменами а-субъединицы Na+,К+-АТФазы. Так, выявлена пространственная сближенность N- и С-концевых внутримембранных сегментов а-субъеднницы HI, Н10 и Н2, Н8 при анализе трехмерной ее конфигурации [ Survazyan ea 1995 ].
