C-пептид: методы получения
Ряд методов производства инсулина основан на получении данного гормона в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением до инсулина и С-пептида, который является "побочным" продуктом. Кроме этого, прежде чем приступить к рассмотрению способов получения очищенного С-пептида, хотелось бы обратить внимание читателей на то, что разные авторы (и производители тоже) до сих пор не договорились что же считать С-пептидом.
Существует три "варианта" С-пептида.
Первый вариант (самый длинный) - та последовательность, которой отличается проинсулин от инсулина, то есть С-пептид, фланкированный с двух сторон катионными парами.
Второй - С-пептид с одной катионной парой на С-конце (продукт протеолиза проинсулина трипсином) и
третий (самый короткий) С-пептид без катионных пар. На мой взгляд, С-пептидом следует называть последний вариант потому, что катионная пара, которая отщепляется от С-конца В-цепи инсулина в процессе созревания гормона аналогична катионной паре на С-конце С-пептида и тоже узнается экзопротеолитическими ферментами (например, кабоксипептидазой В). Следовательно, при биосинтезе С-пептида образуется именно третий вариант.
После этого уточнения можно рассмотреть микробиологические способы получения С-пептида.
Совместное с инсулином. При данном способе генно-инженерные С-пептид и инсулин образуется в ходе ферментативного расщепления трипсином и карбоксипептидазой В [ Миргородская О.А., Казанина Г.А. и др, 1977 , Кудрявцева Н.Е., Жигис Л.С. и др, 1995 ] проинсулина человека который, в свою очередь, получают из гибридного белка, выделяемого из разрушенных клеток рекомбинантных штаммов E. coli. В данной работе [ Клюшниченко В. Е., Акимов С. А. и др, 1992 ] авторы использовали штамм JM 109 N1864 (Государственная коллекция ВНИИА) со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и присоединенного к N-концу через остаток метионина фрагмента белка А Staphylococcus aureus. Культивирование насыщенной биомассы рекомбинантных клеток обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого приводят к получению конечных продуктов (С-пептида и инсулина).
Другая группа исследователей [ Cowley D.J., Mackin R.B., 1977 ] получала в бактериальной системе экспрессии слитый рекомбинантный белок, состоящий из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового хвоста . Его выделяли используя хелатную хроматографию на колонках с Ni-агарозой [ Ford C.F., ea, 1991 ] из телец включения и расщепляли бромцианом. Авторы определили, что выделенный белок является S-сульфонированным. Картрирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионообменной хроматографией на анионите и ОФ ВЭЖХ, показали наличие дисульфидных мостиков, соответствующих дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека. Позднее, в работе [ Mackin R.B., 1999 ] была описана упрощенная процедура выделения проинсулина, полученного по аналогичной схеме, с использованием только ОФ ВЭЖХ.
В работе [ Hartman J., Mendelovitz S., ea, 1994 ] сообщается о разработке нового, усовершенствованного способа получения инсулина человека методами генной инженерии в прокариотических клетках. Авторами установлено, что полученный инсулин по своему строению и биологической активности идентичен гормону, выделенному из поджелудочной железы.
В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так в работе [ Castellanos-Serra, ea, 1996 ] авторы получили слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина 2 присоединенного к N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессировался и локализовался в тельцах включения. После выделения белок расщеплялся трипсином с получением инсулина и С-пептида.
Другая группа исследователей [ Nilsson J., Jonasson P., ea, 1996 ] действовала аналогичным способом. Слитый белок из проинсулина и двух синтетических доменов, связывающих IgG, полученных на основе белка А стафилококков локализовался в тельцах включения, но обладал более высоким уровнем экспрессии. Белок выделялся аффинной хроматографией с использованием IgG и обрабатывался трипсином и карбоксипептидазой В. Полученные инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ.
В работе [ Sun H., ea, 1995 ] описано получение мутанта проинсулина, который содержал замену Arg32Tyr. При совместном расщеплении этого белка трипсином и карбоксипептидазой В образовывался нативный инсулин и С-пептид содержащий остаток тирозина. Последний после мечения 125I активно используется в радиоиммунном анализе. Полипептиды, предназначенный для изготовления лекарственных препаратов, должны быть высокой чистоты. Поэтому необходим высокоэффективный контроль за чистотой получаемых продуктов на каждой стадии производства. Ранее с помощью ОФ и ИО ВЭЖХ были охарактеризованы проинсулин-S-сульфонат, проинсулин, отдельные А- и В-цепи и их S-сульфонаты [ Peter A., Szepesi G., ea, 1987 ], также особое внимание уделялось флуоресцентным производным инсулина [ Петроченко Е.В., Киселев П.А., 1996 ]. В работе [ Клюшниченко В. Е., Акимов С. А. и др, 1992 ] авторы исследовали применимость и информативность хроматографических методов при анализе продуктов всех стадий производства инсулина человека и составили регламент хроматографических операций позволяющий эффективно разделять и охарактеризовывать полученные продукты. Авторы [ Романчиков А.Б., и др, 1997 ] разделяли производные инсулина используя бифункциональные сорбенты (гидрофобная и ионообменная ОФ ВЭЖХ) и показали возможность управления селективностью разделения варьируя вклад каждого из взаимодействий, благодаря чему достигается большая эффективность при разделении близких аналогов белка. Кроме того, разрабатываются подходы для автоматизации и ускорения процессов определения чистоты и количества конечных продуктов. Индивидуальное (в составе слитых белков) При создании слитых конструкций весьма существенным является соотношение молекулярных масс белка носителя и целевого полипептида. Так в работе [ Jonasson P., ea, 1998 ] описано конструирование слитых конструкций, где в качестве белка носителя использовали белок, связывающий сывороточный альбумин человека, к которому присоединяли один, три и семь С-пептидов с остатком тирозина на N-конце. С-пептиды соединялись по принципу голова-хвост с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления слитого белка трипсином. Слитые белки локализовались преимущественно в цитоплазме и имели схожие уровни накопления (около 50 мг на литр ночной культуры). ВЭЖХ продуктов расщепления этих трех слитых белков показала, что отщепление С-пептида проходит количественно. Это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.
Та же группа авторов [ Jonasson P., ea, 2000 ] получила высокоэффективный штамм-продуцент слитого белка, содержащего в своем составе семь С-пептидов на основе штамма Escherichia coli О17. Уровень накопления слитого белка в цитоплазме составил 1.8 г на литр ночной культуры. Разработанная технология получения С-пептида включала в себя преципитацию нуклеиновых кислот после лизиса клеток с последующим выделением слитого белка ионообменной хроматографией на Q Sepharose FF (анионит). Затем очищенный слитой белок подвергали протеолизу трипсином и разделяли продукты расщепления ОФ ВЭЖХ и гель-фильтрацией. Данный метод позволил получить 400 мг С-пептида (чистота 95 %).
