Кальций: методы измерения в цитоплазме
Концентрация свободного кальция ( Ca2+ ) в цитоплазме составляет в состоянии покоя 0,1мкМ и повышается до 10мкМ. Свободный цитоплазматический кальций составляет малую долю от всего внутриклеточного кальция. Впервые измерения концентрации цитоплазматического кальция в живых клетках удалось провести в 1967 г. Это было сделано с помощью инъекции белка акворина излучающего в присутствии кальция видимый свет (470нм). Аналогичным свойством обладает белок обелин из гидры [ Campbell,1974 ]. Методы измерения кальция с помощью этих белков очень чувствительны, главная трудность связана с введением белков в клетки. Подробно методику использования акворина см. в обзоре [ Cobbold, Rink,1987 ]. В 70-е годы была разработана методика измерения кальция с помощью селективных микроэлектродов [ Simon ea,1978 ] и адсорбционных металлохромных зондов арсеназо III и антипирилазо III [ Scarpa ea,1978 ]. Все эти методы не нашли широкого применения и к началу 80-х годов уровень цитоплазматического кальция был измерен для очень немногих типов клеток. Качественный скачек в изучении регуляции кальцевого обмена произошел в 1981 году, когда был синтезирован флоуресцентный зонд квин-2 и предложен новый способ переноса его в клетки [ Tsien,1981 ]. Основой для создания квина-2 и синтезированных позднее кальциевых зондов второго ( фуро-2 и индо-1 ) и третьего поколения ( флуо-3 , род-2 и др.) послужил кальциевый хелатор БАФТА [ Tsien,1980 ] рис.7 . По параметрам связывания кальция БАФТА превосходит ЭГТА , у него на порядок большая селективность для кальция по отношению к магнию, более высокие скорости связывания и диссоциации, отсутствует влияние протонов на связывании при pH выше 7,0 [ Cobbold,Rink,1987 ].
Все эти зонды имеют большой отрицательный заряд и неспособны проходить через плазматическую мембрану. Транспортировка в клетку кальциевых зондов осуществляется после нейтрализации отрицательных зарядов карбоксилов присоединением ацетооксиметильных групп ( рис.8 Транспорт в клетку кальциевых зондов ). В цитоплазме клеток эфирные связи разрываются и высвобождается свободная кислота, способная связывать кальций. Благодаря этому происходит концентрация зонда в цитоплазме (в клеточной суспензии 10-20 мкМ, в цитоплазме 0,5- 1 мМ). Подробно о флоуресцентных зондах для измерения концентрации кальция в цитоплазме см. в книге [ Авдонин, Ткачук,1994 ].
