Рецепторы: выделение и идентификация
Основной метод идентификации рецепторов в клетках или субклеточных структурах (и практически единственный, применяемый при очистке рецепторов)- измерение связывания агониста или антагониста. Специфическое связывание агонистов с рецепторами протекает по кинетике с насыщением. Это быстрый и обратимый процесс. В отличие от неспецифического такое связывание блокируется химическими аналогами данного агониста. Если существуют два стереоизомера вещества, то один из них, как правило, связывается с рецепторами гораздо лучше другого. Для неспецифического связывания различия в стерической конфигурации веществ обычно не существенны. Перечисленные особенности лежат в основе существующих ныне методов изучения взаимодествия веществ с рецепторами.
Весьма эффективным инструментом в изучении рецепторов является метод слияния разных клеток. См. рецепторы: исследования путем слияния клеток
Все рецепторы, известные в настоящее время, обнаружены по биологическим эффектам гормонов. Агонисты и антагонисты гормонов также выявляются в основном в физиологических экспериментах. Если гормон влияет на функциональную или метаболическую активность ткани (например, вызывает деполяризацию мембран или образование свободных жирных кислот), говорят о наличии в данной ткани рецепторов для этого гормона. О силе действия агонистов судят, сравнивая их биологические эффекты с эффектом гормона; антагонисты выявляют по блокированию этих эффектов. Так, например, многие холиномиметики обнаружены путем сравнения величины деполяризации или гиперполяризации, вызываемой ацетилхолином и исследуемым веществом, а холинолитики - по способности уменьшать действие ацетилхолина на мембранный потенциал. Подобным образом была составлена и классификация адренергических агентов. При этом экспериментатор, как правило, изучает зависимость эффекта (потенциал, распад гликогена или освобождение жирных кислот) от концентрации гормона, его агонистов и антагонистов и тем самым оценивает сродство этих агентов к рецептору. Абсолютные величины констант, получаемые в такого рода экспериментах, в большинстве случаев являются кажущимися. Они могут на несколько порядков отличаться от истинных констант связывания гормона с рецептором.
Выделение рецепторов затруднено в связи с их низкой концентрацией, а также тем, что после разрушения клеток, выделения и очистки субклеточных структур рецепторы, локализованные в этих структурах, нельзя тестировать по их биологическим эффектам, так как в большинстве случаев биологический эффект опосредуется согласованной работой многих структур, а подчас и вовсе требует целостности клетки или даже определенного многоклеточного ансамбля.
Поверхность типичной клетки содержит 10000 - 20000 рецепторов к отдельному гормону, что соответствует 10-6 от общего белка клетки. Для выделения рецепторов прежде всего следует солюбилизировать интегральные белки мембраны с помощью неионнного детергента. Солюбилизированный таким образом рецептор далее может быть очищен с помощью аффинной хроматографии. В этом случае лиганд соответствующего рецептора химически связывается со специальной матрицей (например, полистироловые шарики). Далее грубая фракция мембранных белков пропускается через такую колонку. И только рецептор свяжется со своим лигандом. Тем не менее, для многих гормонов количество рецепторов на клеточной поверхности слишком мало для того, чтобы получать их с использованием аффинной хроматографии. Поэтому ключевые рецепторные белки могут быть получены с помощью ДНК- клонирования и других рекомбинантных ДНК методов.Так, например, после получения очищенной фракции плазматических мембран альфа-адренергические рецепторы не удается тестировать по повышению проницаемости этих мембран для Ca2+, так как такие мембраны обычно становятся свободно проницаемыми для всех ионов. Тестировать бета-адренергические рецепторы по ускорению липолиза нельзя после разрушения жировой ткани и выделения мембран. Однако эти мембраны содержат аденилатциклазу, активация которой является первым этапом в процессах ускорения липолиза бета-адренергическими агонистами.Тестируя бета-рецепторы по активации аденилатциклазы, можно выделить и очистить плазматическую мембрану, в которой локализованы и бета-рецепторы и аденилатциклаза. Следующим этапом должна быть солюбилизация мембраны детергентами или органическими растворителями, так как практически все мембранные рецепторы - интегральные белки. После солюбилизации аденилатциклаза сохраняет свою активность, но утрачивает способность активироваться гормонами, поэтому при дальнейшей очистке рецепторов уже не удается проводить "функциональный" контроль.
