ДНК-полимераза бета: активность
ДНК-полимераза бета обладает двумя ферментативными активностями - ДНК-полимеразной (5'-3'-дезоксинуклеотидилтрансферазной) и дезоксирибофосфатлиазной (dRp- или AР-лиазной), удаляющей 5'-концевые апуриновые/апиримидиновые остатки (AР-сайты), ограничивающие бреши в ДНК, по механизму бета-элиминирования [ Matsumoto Y., Kim K., 1995 , Piersen C.E. et al., 1996 ]. Обе активности ДНК-полимеразы бета требуют присутствия ионов двухвалентных металлов в реакционной смеси и подавляются в присутствии EDTA.
Полимеразная активность ДНК-полимеразы бета не ингибируется афидиколином, сульфгидрильными ядами и аналогами нуклеотидов BuAdATP и BuPhedGTP, но подавляется в присутствии d2TTP ( табл. 1 ).
Полимеразная активность ДНК-полимеразы бета, как и активность в реакции эксцизионной репарации основания in vitro, специфически подавляется N-концевым 14 кДа-фрагментом, который не влияет на другие ДНК-полимеразы млекопитающих и на ДНК-полимеразу I E. coli [ Husain I. et al., 1995 ].
Сравнение структур ДНК-полимеразы бета в комплексе с ДНК, содержащей мононуклеотидную брешь и разрыв, позволило предложить модель изменения конформации фермента в ходе каталитического акта и показало наличие в матричной ДНК изгиба в 90* в месте бреши (разрыва) [ Sawaya M.R. et al., 1997 ]. Сочетание способности к заполнению брешей размером в 1 н. и 5'-дезоксирибофосфатлиазной активности делает ДНК-полимеразу бета идеальным ферментом для репарации с вырезанием основания, когда происходит замена только одного нуклеотида с неправильным основанием [ Wilson D.M., Thompson L.H., 1997 ].
Участие ДНК-полимеразы бета в эксцизионной репарации основания in vivo показано с помощью мутационного анализа [ Sobol R.W. et al., 1996 ].
С этой функцией согласуются ферментативные свойства ДНК-полимеразы бета. Фермент наиболее эффективно действует (показывает максимальное значение kcat/KM,dNTP) на мононуклеотидных брешах, когда ограничивающий брешь 5'-конец фосфорилирован [ Chagovetz A.M. et al., 1997 ]. Эффективность фермента в 500 раз ниже на мононуклеотидных брешах с нефосфорилированным 5'-концом и на брешах размером 6 н. и в 2500 раз ниже на обычных праймер-матричных комплексах без брешей.
Частота ошибок ДНК-полимеразы бета также минимальна на мононуклеотидных брешах, ограниченных фосфорилированным 5'-концом. На брешах с нефосфорилированным 5'-концом и на других ДНК-субстратах частота ошибок фермента в 10-100 раз выше [ Chagovetz A.M. et al., 1997 ].
Группа Тсаи подтвердила существенно более высокую каталитическую эффективность фермента на мононуклеотидных брешах, однако не наблюдала значительного увеличения точности копирования при заполнении этих брешей [ Ahn J.W. et al., 1998 ].
Таким образом, основная функция ДНК-полимеразы бета в клетке заключается, вероятно, в заполнении брешей размером 1 н. с фосфорилированными 5'-концами в ходе "short-patch" репарации. На протяженных однонитевых матрицах ДНК-полимераза бета осуществляет дистрибутивную полимеризацию, присоединяя к затравке по одному нуклеотидному остатку за один цикл связывания с праймер-матричным комплексом. Однако при заполнении коротких брешей в двунитевой ДНК ДНК- полимераза бета способна осуществлять процессивный синтез, застраивая за один цикл бреши размером от 4 до 6 н. [ Prasad R. et al., 1994 ].
Процессивное заполнение коротких брешей показывает, что ограничивающий брешь 5'-конец стабилизирует комплекс фермента с праймер- матричным комплексом. Участок связывания с 5'-концом ДНК в ферменте перекрывается, вероятно, с дезоксирибофосфатлиазным центром. Показано, что домен 8 кДа ДНК-полимеразы бета в присутствии ионов Mg2 обладает сродством к фосфорилированному 5'-концу бреши, когда размер бреши составляет 1-5 н. [ Matsumoto Y., Kim K., 1995 ].
Таким образом, связанный одновременно с обоими концами бреши фермент способен застраивать ее в ходе процессивного синтеза. Это позволяет ДНК-полимеразе бета участвовать также в "long-patch" репарации, при которой происходит встраивание нескольких нуклеотидных остатков в районе бреши, возникшей после вырезания поврежденного участка. Показано, что ДНК-полимераза бета эффективно репарирует пары нуклеотидов типа G:U, где уридин является продуктом дезаминирования цитозина [ Sinqhal R.K. et al., 1995 ], а также модифицированные алкилирующими агентами основания [ Narayan S. et al., 1996 ] и образованные под действием гамма-облучения окисленные AР-сайты [ Klungland A., Lindahl T., 1997 ].
Уровень активности ДНК-полимеразы бета не меняется на протяжении клеточного цикла. Однако в присутствии агентов, повреждающих геномную ДНК, может наблюдаться индукция этого фермента, что согласуется с репаративной функцией ДНК-полимеразы бета. Так, обработка культуры клеток хомячка алкилирующим агентом N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (MNNG) индуцирует экспрессию гена ДНК-полимеразы бета и повышает клеточный уровень фермента [ Narayan S. et al., 1995 ].
Активность ДНК-полимеразы бета также коррелирует с количеством однонитевых разрывов в ядерной ДНК клеток печени, возникающих после обработки афлатоксином В-1 [ Webster R.P., Bhattacharya R.K., 1995 ].
В точности копирования ДНК-полимераза бета уступает репликативным ДНК-полимеразам альфа , дельта и эпсилон [ Werneburg B.G. et al., 1996 , Beard W.A., Wilson S.H., 1998 ]. В отличие от ДНК-полимераз альфа, дельта и эпсилон, которые останавливаются, достигая группы d(GpG)-цис-платины в гене HRAS человека в условиях in vitro, ДНК-полимераза бета успешно преодолевает этот модифицированный участок [ Hoffmann J.S. et al., 1995 ]. Таким образом, она является единственной из ядерных ДНК-полимераз, способной продолжить синтез "прерванных" продуктов репликации других ДНК-синтезирующих ферментов, что указывает на роль ДНК-полимеразы бета в фиксации мутаций в геноме эукариот.
Репликация in vivo нерепарированных повреждений О6-метилгуанина (m(6)dG), осуществляемая ДНК-полимеразой бета, также может привести к появлению мутаций [ Singh J. et al., 1996 ]. Против m(6)dG ДНК-полимераза бета предпочтительнее встраивает dTMP по сравнению с dCMP. Когда вместо природного AР-сайта используют его синтетическое производное тетрагидрофуран, ДНК-полимераза бета дуплицирует нуклеотид, комплементарный нуклеотиду, предшествующему AР-сайту [ Efrati E. et al., 1997 ].
