ДНК изгибы: динуклеотиды CA/TG: особенности
a) Характер электрофоретической подвижности. Присутствие CA/TG дублета на 5' конце полиА тракта может усилить тенденцию к изгибу ( Koo et al, 1991 ). Интересно заметить, что CA/TG динуклеотид часто присутствует на границе кинетопластных фрагментов ДНК, имеющих природой определенный изгиб. В пользу влияния СА стыка с А трактами на способность к изгибанию, вероятно, может служить исследование мультиплетов d(C2A6C2)n, d(C2A6G2)n, d(G2A6G2)n. Изучение подвижности в геле демонстрирует, что это - ряд по порядку уменьшения аномалии подвижности в геле ( Abagyan et al, 1989 ).
При изучении подвижности в ПААГ олигонуклеотиды ( McNamara et al,1990 ), имеющие (CA)n в своем составе, проявляют незначительной по сравнению с А-трактами аномалию подвижности, но кривая зависимости коэффициента замедления в акриламидном геле с возрастанием длины имеет максимум при определенной длине полимера в отличие от монотонно возрастающего характера зависимости, свойственной для полиА трактов. Это означает что, при электрофорезе, начиная с определенной длины ДНК, начинают сказываться структурные особенности, связанные с (CA)n трактами. Пониманию этих особенностей способствовали работы по изучению других физико-химических свойств.
б) Чувствительность к действию реагентов. Было показано, что на 5' границе А-тракта в составе C5A5G именно CA, как граничный динуклеотид, в большей степени подвержен действию KMnO4, особенно при низких темпратурах, этот же динуклеотид доступен в большей степени и гидроксил радикальному расщеплению ( Nagaich et al, 1994 ), чем другие динуклеотиды. Максимум скорости имино-протонного обмена в дуплексных сегментах ДНК приходится на CA/TG последовательности ( Li et al, 1985 ). Все это свидетельствует о большей открытости этой пары для реагентов.
в) Взаимодействие с белками. В других работах приводится информация о том, что CA,CAC,CACA гетеронуклеотиды кносят вклад в анизотропию гибкости ДНК и облегчают белок-индуцированное изгибание ДНК (cro белок)(( Lyubchenko et al, 1993 ; Tillius & Dombroski, 1986 ). В структурах ДНК-белковых комплексов есть примеры образования белком индуцированных стабильных изломов, так называемых "kink'ов" в СА паре, в частности, в комплексе ДНК с CAP белком (угол раскрытия CA пары составляет 40о) ( Steitz, 1990 ; Schultz et al, 1991 ).
г) Особенности температурного плавления СА-содержащих фрагментов. При сравнении плавления мультимерных фрагментов на основании олигонуклеотидов C5A5G и GA5C6 только первый олгонуклеотид, содержащий CA стык характеризуется переходом из состояния предплавления в фазу глобального выплавления по мере повышения температуры ( Nagaich et al, 1994 ), хотя GC-содержание у них одинаковое. Наличие стадии предплавления (низкотемпературного плеча в профиле кривой плавления) связывается с присутствием CA динуклеотида.
д) Способность к циклизации. При возрастании n в (CA/TG)n тракте, входящих в состав синтетических олигонуклеотидов происходит увеличение вероятности циклизации после их лигирования ( Fedoseyeva & Alexandrov, 1998 ).
е)Данные ЯМР, расчетные методы. Гибкость пиримидин-пуринов CA и CG. Данные ЯМР позволяют позволяют оценить сахаро-фосфатные двугранные углы через измерения констант спаривания, а также конформация сахаров ( Schmitz et al, 1992 ; Ulyanov et al, 1995 ; Gaudin et al, 1995 ; Lefebvre et al, 1995 ; Conte et al, 1996 ). При этом спиральные параметры не могут быть измерены напроямую, но могут быть выведены из интерпротонных расстояний нуклеотидов. Насколько точно В-ДНК структура может быть определена из объединенных данных ЯМР-спектроскопии и методов молекулярного моделирования? Вообще говоря, хорошие результаты могут быть получены в первую очередь для таких параметров, как спиральный уголы "twist" и "roll" ( Ulyanov et al, 1995 , Metzler et al, 1990 ; Lane, 1990 ; Kaluarachchi et al, 1991 ).
Пример рассмотрения этого вопроса для определенной группы олигонуклеотодов демонстрирует, что среди 3 углов ("twist", "roll" и "tilt") и 3 параметров транслокаций ("shift", "slide" и "rise"), которые определяют структуру динуклеотида, "twist" наиболее легко определяется этими методами, тоже можно сказать о "role", "shift" и "slide" параметрах, "rise" и "tilt" легко не определяются, но они сами по себе не сильно варьируют ( Lefebvre et al, 1997 ). Часто величины спиральных углов и их взаимозависимости определяются конформацией сахаро-фосфатного остова. Так, в работе [] анализируются энергетические зависимости, связанная с BI/BII переходами для разных динуклеотидов. Анализ кристаллографических данных свидетельствует о вариабельности двугранных углов сахаро-фосфатного остова C4'-C3'-O3'-P и C3'-O3'-P-O5', причем изменения этих углов как правило скореллированы. BI конформация соответствует разнице между их величинами приблизительно в -90 градусов (это наиболее вероятная конформация в общем случае), а BII конформация разнице в +90 градусов ( Fratini et al, 1982 ). Результаты молекулярного моделирования дают представления о том, что BI/BII переходы энергетически более предпочтительны для CpA и CpG, чем для TpA и RpY динуклеотидного стыка. Анализ влияния соседей выявляет, что наиболее облегчены BI/BII переходы в случае (Y)n(R)n последовательностей. Вариации сахаро-фосфатных двугранных углов могут приводить к деформациям спиральных параметров "twist","slide", что в свою очередь может приводить в потерям в энергиях стекинга. Это и может объяснить в свою очередь повышенную гибкость CpA и CpG динуклеотидов, а именно, механизм гибкости может быть связан с возможностью существования 2 низкоэнергетических состояний (отличающимися конформационными параметрами и конфигурацией фосфо-диэфирной связи) и переходами между ними.
В работах по ЯМР также показано, что САС сайты в ДНК могут обладать необычной структурой, связанной с частичной расстыковкой (ослабления стекинга) пар оснований ( Lu et al, 1983 ; Cheung et al,1984 ; Patel et al, 1987 ). Методы молекулярного моделирования с использованием ограничений, накладываемых, исходя их данных ЯМР спектроскопии, свидетельствуют о том, что CA и CG динуклеотидные пары являются наиболее конформационно пластичными (дают наибольшие отклонения спиральных параметров от равновесных при одних и тех же приращениях энергии в районе энергетического минимума) ( Lefebvre et al, 1995 ; Lefebvre et al, 1996 ; Lipanov et al, 1993 ; Grzeskowiak et al, 1991 ; Quintana et al, 1992 ; Timsit et al, 1991 ; El Antri et al, 1993 ; Timsit & Moras, 1995 ; Lefebvre et al, 1997 ).
з) Кристаллографические данные В работе ( Suzuki & Yagi, 1995 ) использование обширного материала по структуре олигонуклеотидов в закристаллизованной форме, а также их комплексов с белками (структуры включают 909 динуклеотидных шагов) создает представление о значительной дисперсии таких конформационных параметров как roll, twist и др. ( Рис.1-1 ). Наиболее сильные вариации параметров характерны для пиримидин-пуриновых динуклеотидов, из них самые значительные для CA/TG стыка. Наблюдается значительная спаренность высокого "twist" и отрицательного "roll", а также низкого "twist" и положительного "roll". В другой работе на основе анализа локальной спиральной геометрии динуклеотидов в составе 11 вариантов олигомеров ( Yanagi et al, 1991 ) отмечается усредненная по многим типам соседей закономерность. Выявлено, что систематические и качественные связи существуют между определенными типами спиральных параметров ДНК в кристаллах. По крайней мере, существуют два типа профилей:
HTP(high twist profile - профиль с высоким значением торсионного угла), характеризующийся высоким углом "twist", отрицательным углом "roll" (двугранным углом между соседними динуклеотидами при вращении вокруг большой оси пары), низким значением величины "rise" (расстоянием между двумя соседними нуклеотидами),
LTP(low twist profile - профиль с низким значением торсионного угла), характеризующимся низким значением угла twist, положительным углом "roll", и высоким "rise".
Примеры HTP - динуклеотиды G-C, G-A, Y-C-A-R, где Y - пиримидин, а R - пурин.
Примеры LTP - динуклеотиды C-G, G-G, A-G, и C-A все кроме Y-C-A-R. Остальные пары не попадают под схему классификации по этому профилю. Другие закономерности : малая бороздка особенно узка для следующих пар - A-T,T-A,A-A и G-A. Анализ локальной спиральной геометрии CA/TG динуклеотида проведен на основе многих вариантов олигомеров ( Yanagi et al, 1991 )
Додекамеры, использованные для анализа: C-G-C-G-A-A-T-T- C-G-C-G Wing et al,1980 C-G-C-G-A-A-T-T-brC-G-C-G Fratini et al, 1982 C-G-C-G-A-A-A-A- A-G-C-G Nelson et al, 1987 C-G-C-A-A-A-T-T- T-G-C-G Coll et al, 1987 C-G-C-A-T-A-T-A- T-G-C-G Yoon et al, 1988 C-G-C-A-A-A-A-A- T-G-C-G DiGabrieli et al, 1989 C-G-C-G-A-T-A-T- C-G-C-G Coll et al,1989 , Shakked et al, 1990 C-G-T-G-A-A-T-T- C-A-C-G Larsen et al, 1991 Декамеры: C-C-A-A-G-A-T-T-G-G Prive et al, 1987 , Prive et al,1988 C-C-A-A-C-G-T-T-G-G C-C-A-G-G-C-C-T-G-G C-G-A-T-C-G-A-T-C-G Grzeskowiak et al, 1991
