Интасома: роль изгибов в ДНК
При помощи сайт-специфической рекомбинации проходит интегрирование ДНК фага лямбда в хромосому E.coli в случае лизогенного пути развития фага. В этои случае происходит образование сложно структурированного нуклеопротеинного комплекса, т.н. интасомы . Рассмотрим процесс интеграции подробнее в свете влияния на него изгибных свойств ДНК, вызванных равновесными изгибами или белок-индуцированными.
attP и attB сайты. Встраивание происходит по участкам ДНК, которые именуются в дальнейшем как attP (сайт встраивания на ДНК фага ) и attB (сайт интеграции на хромосоме E.coli).
attP и attB имеют область идентичности т.н. "core" длиной в 15 нп. В каждом случае эти 15 нп вместе с несколькими соседствующими нуклеотидными парами создают пару инвертированных мест связывания для Int белка ( Ross & Landy, 1983 ). Из двух сайтов интеграции, только фаговый должен находиться в составе репликона в сверхспирализованном состоянии, тогда как работа бактериального сайта не зависит от его топологического состояния ( Mizuuchi & Mizuuchi 1979 ).
Нуклеотидные последовательности локусов att известны. 4 первичных att локуса (P,B,L,R) имеют 15 нп общую "core" последовательность, по которым происходит кроссинговер ( Landy & Ross, 1977 ). Минимальный функциональный attP сайт включает приблизительно 240 нп, окружающий "core", от -160 нп до 82 нп ( Hsu et al, 1980 ), тогда как минимальный attB сайт не много длиннее общего "core" ( Mizuuchi et al, 1981 ). Последовательность "core" и прилегающих к ней инвертированных повторов, включающих несколько нуклеотидов и составляющих непосредственно сайт связывания Int белка att
caGCTT-TTTTATACT-AAgttg. Через дефис на флангах выделены инвертированные повторы сайта связывания с белком Int , а крупными буквами консервативные участки для attP и attB.
Всего на att ДНК имеется до 15 мест связывания с белками Рис 18 . Некоторые места связывания с белками требуются для реакции встраивания и исключения , некоторые (P1,P'3 и H1) используются исключительно для встраивания, другие (P2, P'1) - только для исключения ( Thompson et al, 1987 , Thompson et al, 1987 , Bushman et al, 1985 , Kim et al, 1990 , Bauer et al, 1986 , Winito et al, 1986 ).
Int белок Int белок, кодируемый фагом, является сайт-специфической топоизомеразой. Очищенный Int белок взаимодействует с 4 отдельными и несоседствующими сегментами attP сайта, включая локус кроссинговера ( Ross et al, 1979 , Hsu et al, 1980 ), а также Int-белок обладает топоизомеразной активностью. С "core" элементом белок связан своим С-концом, с P сайтами - своим N концом (уточнить). Этот фаговый бивалентный белок Int (интеграза) осуществляет разрезание и сшивание по "core" сайтам фага и бактерии, осуществляя рекомбинацию, при этом при интегрировании задействованы сайты core и Р1, Р2, т.е. сайты Р плеча и соответственно Р петли, с которыми одновременно кооперативно взаимодествует Int белок; при эксцизии (исключении) ДНК фага из хромосомы дополнительно задействованы локусы Р' плеча и соответственно Р' петля. Рис 18
IHF белок Чтобы свести воедино в пространстве "core" сайты и P1 сайт, отстоящий далеко по последовательности, используется хозяйский бактериальный белок IHF(integration host factor). Если бивалентный Int белок не изгибает ДНК, но связывается одновременно с двумя сайтами, то IHF значительно изгибает ДНК в каждом из 3 мест связывания H1,H2,H3 ( Craig & Nash, 1984 , Robertson &Nash, 1988 ). IHF может изгибать ДНК более, чем на 140о и является главным определителем искривленности пути в att сайте. Как ранее было известно attP сайт имеет собственную внутреннюю кривизну ( Reed & Landy, 1982 ).
Изгиб в H2 сайте, созданный INF белком, не совпадает по фазе приблизительно на 100о (имеется в виду торсионный угол twist) по отношению к H1 сайту, а также отличается и торсионные углы между H2 и H', тогда картина искривления ДНК получается как на Рис 18 .
Xis и Fis белки. К изгибающим ДНК белкам относятся белки Xis и Fis, необходимые для образования рекомбиногенных структур ( Thompson & Landy, 1988 , Robertson & Nash, 1988 , Moitoso de Vargas et al, 1989 , Goodman & Nash, 1989 ). Хотя Fis не является основным белком и не может заменить Xis, он стимулирует Xis-зависимые реакции в случаях лимитирования Xis белка ( Thompson et al, 1987 ).
Особую роль выполняет фагоспецифичный Xis белок. Он связывается с двумя близкими сайтами X1, X2F, расположенными между P2 и H2, изгибая ДНК и создавая свою петлю, альтернативную Р петли, необходимой для интегрирования. Этот сдвиг изгиба в Р петле от H1 к X1X2/F сайтам приводит к рекомбинационно инертной структуре, не способной к интегрированию, сам Xis белок выступает в качастве переключателя пути развития фага с лизогенного на литический путь. Следствием его взаимодействия со своими сайтами вытекает и эффект дальнодействия, а именно,
(i) уменьшается связывание Int белка с P1 сайтом,
(ii) стимулируется связывание Int белка с P2 сайтом,
(iii) ингибируется связывание IHF белка с H1 сайтом и (iv) предотвращается связывание Int белка с P'3 сайтом ( Moitoso de Vargas & Landy, 1991 ).
