Механизм действия резолвазы: участие изгибов ДНК
Сайт-специфическую рекомбинацию рассмотрим на этапе разрешения (резолюции) коинтегратной молекулы на две другие молекулы, что является конечным этапом процесса транспозиции. Такой выбор связан с тем, что именно на этом этапе изгибные свойства ДНК (равновесные изгибы и белок-индуцированные) имеют радикальное влияние на весь процесс и это экспериментально достаточно основательно документировано. На примере гамма-дельта - одного из прокариотических транспозонных элементов, родственного Tn3, - рассмотрим сайт-специфическую рекомбинационную систему ( Heffron, 1983 , Grindley & Reed, 1985 ). Роль этой рекомбинации заключается в разделении коинтегратных молекул, продуктов слияния молекулы донора транспозона и молекулы мишени. Процесс рекомбинации катализируется резолвазой, продуктом гена tnpR, кодируемым самим транспозоном. 3 места связывания резолвазы с ДНК находятся на фрагменте длиной 115 нп, рядом с 5' концом гена tnpR. Процесс разрешения происходит по месту связывания I ( Reed & Grindley 1985 ), но для эффективности процесса необходимо все три места связывания. Специфическое пространственное устройство обеспечивает процесс рекомбинации. Как выяснилось, три точки ДНК, должны быть пространственно сведены вместе для осуществления процесса рекомбинации ( Cozzarelli et al, 1984 , Wasserman & Cozzarelli,1985 , Wasserman et al, 1985 ). Пересечение этих узловых точек может возникнуть при сворачивании 2 фрагментов ДНК, содержащих места резолюции, выгнутых в тороидальные петли. Электронномикроскопическое изучение коплексов резолвазы с ее сайтами (как одиночного комплекса, так и сайтов коинтегратной молекулы, находящихся в синапсе) указывает на то, что структура сильно конденсирована ( Salvo & Grindley,1988 ). Изучение аномальной подвижности фрагментов ДНК в комплексе с резолвазой привело к выводам о том, что в комплексах резолвазы с отдельными фрагментами, включающими res сайт, существуют 2 типа белок-индуцированных изгибов в ДНК:
(i) внутрисайтовые изгибы, которые являются следствием взаимодействия между димерами резолвазы и 3 местами связывания, составляющими res фрагмент. Внутрисайтовые изгибы для всех 3 сайтов связывания могут отличаться друг от друга. Так например, изгиб, ассоциирующийся с I сайтом состоит в основном из локализованного "kink"'а (излома), который открывает узкую бороздку в точке кроссинговера и делает ее доступной интеркалирующему агенту метидиумпропилу EDTA[MPE. Fe(II)]( Hatfull et al 1987 ). При тех же условиях этот интеркалятор не действует на сайты II и III, а для их внутрисайтоавых изгибов имеют значение полиT тракты
(ii) межсайтовый изгиб (между сайтами I и II), на картину расщепления последовательности которого ДНказойI, оказывает влияние присутствие дистального сайтаIII, а также инсерции целого или полуцелого числа витков спирали. Этот эффект дальнодействия можно объяснить образованием петли из res фрагмента, тогда сам факт скрепления структуры в петлю и соответственно ограничение флуктуаций может объяснить влияние одного элемента на дистально расположенный другой элемент.
Последовательный учет всех изгибов, межсайтовых и внутрисайтовых, в том числе полиA/T трактов и расстояний между ними, близких к целому числу витков спирали, позволяет подтвердить возможность образования такой петли. Экспериментально наличие такой структуры подтверждается картиной распределения чувствительности к ДНказеI, когда расщепляются в значительной степени внушние стороны ДНК, создающие петлю. См. рис 17 Когда спариваются две таких петли, созданные из двух "res" фрагметов, и образуют синаптическую структуру, затрачивается энергия негативной сверхспирализации, при этом сайты II и III одной петли взаимодействуют с III и II сайтами другой петли в антипараллельной конфигурации. Если одиночная петля поддерживается белок-белковыми взаимодействиями, то для поддержания синаптической структуры внутрифрагментные белок-белковые взаимодействия хотя бы частично заменяются на межфрагментные белок-белковые взаимодействия при сведения их в пространстве ( Benjamin & Cozzarelli, 1988 ).
Для окончательного разрешения процесса резолюции, по крайней мере, требуются белки с топоизомеразной активностью ( Wang, 1987 , Wang et al,1988 )
Резюмируя вышесказанное, следует отметить, что для пространственного функционирования этой довольно сложной схемы имеет значение наличие как равновесно изогнутых последовательностей, так и гибких локусов ДНК.
