Петли ДНК прокариот
Искривленная ДНК часто принимает участие в транскрипционной регуляциии, благодаря своей кривизне она помогает осуществить контакты между белками, имеющими разнесенные вдоль ДНК места связывания. Нередко регуляторные белки связываются с областями значительно удаленными от промоторов и для продуктивного связывания с РНК-полимеразой необходимо образование петли в ДНК. Процесс петлеобразования, особенно в случае малых петель, зависит от степени изогнутости ДНК или/и способности изгибаться в нужном направлении в присутствии белка. Подтверждению этому есть немало примеров. ara оперон: участи петель ДНК Первоначальные представления о запетленной структуре ДНК возникли при изучении E.coli ara оперона. AraC/araBAD промоторный регион образует сложную транскрипционную единицу. Транскрипция araBAD мРНК, кодирующей белки метаболизма, положительно регулируется AraC белком более чем в 100 в присутствии арабинозы, и негативно в отсутствии арабинозы, независимо от наличия сахара. AraC белок негативно авторегулирует транскрипцию своего собственного оперона. В зоне araC/araBAD оперона наиболее удаленные 2 сайта связывания с araC белком (в зоне имеется всего 3 сайта связывания) разделены сегментом ДНК в 210 нп. Инсерции между ними фрагментов ДНК равных по длине полуцелому числу витков спирали уменьшают репрессию, а вставки целочисленных по спиральным виткам фрагментов ДНК не меняют функцию ( Dunn et al, 1984 ). Это является свидетельством в пользу образования петли в ДНК. Определенную роль играет наличие А-трактов, и их взаимная локализация, способная создавать результирующий изгиб в ДНК ( Smith & Schleif, 1978 ). В присутствии арабинозы araC белок преимущественно связывается с оператором, находящимся рядом с промотором araBAD, что приводит к активации транскрипции araBAD, и большая петля, видимо, не образуется. Однако, остается возможность для образования малой альтернативной петли, включающей araC промотор, за счет включения в регуляцию третьего сайта связывания, тем самым осуществляется репрессия транскрипции araC оперона и в присутствии арабинозы ( Hamilton & Lee, 1988 ; Huo et al, 1988 ; Lee et al, 1987 ; Lobell & Schleif, 1990 ). Кроме сайтов связывания с araC белком и промоторов, регуляторная область включает и сайт связывания с комплексом CRP.cAMP, который в случае образования такой связи изгибает ДНК в неподходящем для образования петли направлении и тем самым предотвращает репрессию ( Lobell & Schleif, 1991 ; Stoltzfus & Wilcox, 1989 ). Есть данные о том, что для образования петли важно не только собственная кривизна ДНК или белок-индуцированная, но и белок-белковые взаимодействия, когда сами белки предварительно сайт-специфически связаны с ДНК ( Menon & Lee, 1987 ). gal оперон: петли в ДНК Сходная ситуация имеет место для gal оперона. Для него репрессия одного из 2 промоторов также связана с образованием петли между двумя сайтами gal репрессора ( Mandal et al, 1990 ; Harber & Adhya, 1988 ), разнесенными друг от друга на 114 нп ( Irani et al, 1983 ; Lobell & Schleif, 1990 ), причем связывание с сайтами не является кооперативным ( Fritz et al, 1983 ). Для репрессии транскрипции со второго промотора достаточно наличие оператора, расположенного рядом с промотором. Также как в случае ara оперона присутствие cAMP.CRP сайта в промоторной зоне gal оперона предполагает, что связывание с CRP белком или/и РНК-полимеразой может оказывать значительное влияние на способность димеров gal репрессора образовывать репрессорные петли ( Mandal et al, 1990 ). Это подтверждается данными о том, что cAMP.CRP, РНК-полимераза, gal репрессор отдельно сами по себе могут индуцировать изгиб в ДНК в области gal промотора ( Kuhnke et al, 1987 ; Kuhnke et al, 1989 ). lac оперон: петли в ДНК Достаточно документирована схема негативной регуляции lac оперона через образование репрессорной петли. В присутствии lac репрессора при его связывании с первичным сайтом имеет место фоновая экспрессия lac оперона, при появлении же второго дополнительного оператора, уровень экспрессии падает в 2-3 раза, а третий оператор обеспечивает падение синтеза примерно в 50 раз ( Oehler et al, 1990 ). При этом зависимость уровня экспрессии от расстояния между операторами имеет осциллирующий характер, что является достаточно убедительным признаком петлеобразования ( Bellomy et al, 1988 ). К тому же известно, что также как gal репрессор, lac репрессор, связываясь со своим оператором, вызывает изгиб во фрагменте ДНК, ассоциирующийся с областью оператора ( Zwieb et al, 1989 ). deo оперон: петли в ДНК Схема инициации транскрипции deo оперона, кодирующего фферменты нуклеотидного метаболизма в E.coli (deo оперон), включает 2 промотора, которые разнесены на 599 нп ( Dandanell & Hammer, 1985 ). Если один промотор негативно контролируется репрессором DeoR, то второй промотор негативно контролируется двумя репрессорами DeoR и CytR и положительно контролируется комплексом cAMP.CRP ( Valentin-Hansen et al,1986 ). Если два оператора DeoR перекрываются с промоторами, то третий сайт находится на расстоянии в 279 нп выше первого оператора ( Valentin-Hansen et al, 1982 ). Если репрессия обоих промоторов DeoR репрессором в присутствии только одного оператора незначительна (в 2 раза), но она возрастает в 20-30 раз в присутствии 2 операторов и полная репрессия происходит в присутствии всех трех репрессоров. Значительная репрессия также может быть достигнута, если варьиро- вать расстояние между операторами ( Valentin-Hansen et al, 1982 ). Интересно, что если менять расстояние между промотором и удаленным от него оператором (положение оператора, близкорасположенного по отношению к промотору остается неизменным) вплоть до 1-5 тыс. нп, то уровень репрессии остается при этом значительным, лишь частично уменьшаясь при возрастании расстояния. Эти данные легко можно объяснить возможностью образования петель в ДНК. Отметим, что именно этот оперон дает представление о возможных размерах петель особенно в области больших длин. Если петля в ДНК между 2 операторами, образование которой достаточно для заметной репрессии транскрипции, в определенной степени нестабильна, то увеличение стабильности может быть вызвано включением в действие третьего оператора ( Adhya, 1989 ). gln оперон: петли в ДНК Если вышеприведенные примеры образования петель были связаны с репрессией, то приведем пример активации транскрипции, опосредованной петлеобразованием. Дефицит азота в E.coli вызывает активацию генов, продукты которого включаются в метаболизм азота исходя из аммиака и глутамата. Экспрессия glnALG оперона осуществляется на 3 промоторах ( Reitzer & Magasanik, 1986 ). Инициация с одного из этих промоторов требует присутствия сигма-54 субъединицы РНК-полимеразы, NtrC активатора (продукта гена glnG) при условии недостатка азота ( Reitzer & Magasanik, 1986 ; Su et al, 1990 ). Активатор взаимодействует с сильными сайтами связывания, локализованными на расстоянии 110 и 140 нп выше старта транскрипции, и способен при этом облегчить транскрипцию через ускорение перехода в открытый комплекс ( Reitzer & Magasanik, 1986 ). Перемещение этих сильных мест связывания более чем на 1000 нп и изменение ориентации не влияет на стимуляцию. С помощью электронно-микроскопической визуализации было выявлено образование петель соответствующей длины в ДНК в указанной зоне ( Su et al, 1990 ). Другие примеры: петли в ДНК прокариот Аналогичная ситуация существует и в опероне ксилена, в котором XylR белок активирует транскрипцию взаимодействуя с сигма-54 РНК- полимеразой через образование петель ( Inouye et al, 1990 ). nag оперон E.coli кодирует гены, включенные в метаболизм N-ацетилглюкозамина, и имеет сложную регуляторную область, включающем 2 места связывания с регуляторным белком NagC, а в промежутке между ними сайт связывания с cAMP.CRP комплексом ( Plumbridge & Kolb, 1991 ). Такое устройство свидетельствует о том, что репрессия и активация тесно сплетены в этой системе и ситуация аналогична в некоторых аспектах lac оперону. Pap оперон, кодирующий белки биосинтеза пилей в E.coli, имеет сложную регуляторную область: три сайта для регуляторного белка PapB, также как и сайт cAMP.CRP белка ( ForsmanK et al, 1989 ). Такое устройство напоминает ara оперон и предполагает включение множественных ДНК петель в регуляцию генной экспрессии этой системы.
