ПНК - ДНК: повышение специфичности связывания
Проблема повышения специфичности связывания
в применении к комплексам ПНК-ДНК.
Проблема специфичности связывания ПНК с ДНК аналогична проблеме специфичности олигонуклеотидного узнавания. Поэтому для ее решения в принципе возможны сходные подходы. Отличие состоит в том, что ПНК-ДНК комплексы намного стабильнее, и реакцию их связывания можно считать необратимой. Кроме того, для связывания ПНК нужна концентрация намного большая, чем для олигонуклеотидов. Поэтому можно разрушать комплексы в условиях далеких от равновесия. Кратко остановимся на возможных подходах к проблеме повышения специфичности ПНК-ДНК комплексов. Во-первых, можно повысить специфичность реакции внедрения ПНК в ДНК. Известно, что при больших концентрациях ПНК внедряется не только в свой полностью специфичный сайт, но и в другие сайты, отличающиеся от специфичного одной или несколькими нуклеотидными заменами ( Cherny D.Y. ea, 1993 , Demidov V.V. ea, 1995 ). При меньших концентрациях ПНК в реакции количество ошибочных внедрений не столь велико, но при этом не все специфичные сайты находятся в комплексе с ПНК. Поэтому, подобрав время внедрения и концентрацию ПНК, можно добиться оптимального случая, когда достаточно большая доля специфичных комплексов уже образовалась, в то время как количество неспецифичных комплексов достаточно мало ( Рис. Образование специфичных и неспецифичных комплексов ПНК-ДНК ).
Для этого необходимо, чтобы разница в скоростях связывания ПНК с полностью специфическим сайтом и с неспецифическими сайтами, встречающимися на данной молекуле ДНК, была достаточно велика. Такой подход хорошо работает для молекул ПНК и ДНК таких длин, что длина ПНК больше, чем статистически уникальная длина сайта для данной молекулы ДНК. В таком случае вероятность того, что на используемой ДНК найдутся неспецифические сайты, мало отличающиеся от специфического по скорости внедрения, будет невелика, и при правильном выборе времени связывания и концентрации ПНК доля неспецифических комплексов будет небольшой.
Возможен также еще один способ повышения специфичности связывания ПНК - за счет меньшей температурной стабильности неспецифических комплексов ПНК-ДНК. Диссоциация таких комплексов должна происходить при температурах более низких, чем температура диссоциации специфических комплексов.
На Рис. Кривые плавления комплексов ПНК-ДНК приведены кривые плавления комплексов ПНК Т10 с полностью специфическим сайтом (кривая a), а также с сайтами, содержащими 1 и 2 нуклеотидные замены (кривые b и c) ( Egholm M. ea, 1992a ). Видно, что при внесении в сайт одной нуклеотидной замены температура плавления соответствующих комплексов падает на 10 градусов. Можно ожидать, что при температуре около 60 градусов значительное количество неспецифических комплексов ПНК с сайтами с одной нуклеотидной заменой будет разрушено, в то время как полностью специфический комплекс диссоциирует приблизительно на 30%.
Таким образом, после прогревания комплексов ПНК-двунитевая ДНК при определенной температуре можно ожидать существенного повышения специфичности оставшихся комплексов.
