ПОМК крысы: регуляция промотора глюкокортикоидами
Глюкокортикоиды, синтезирующиеся в надпочечниках в ответ на действие адренокортикотропного гормона, выщепляющегося из ПОМК, оказывают обратное негативное влияние на уровне гипофиза, ингибируя секрецию запасенного АКТГ и репрессируя транскрипцию гена ПОМК ( Drouin J. ea, 1990 ). В экспериментах на трансгенных мышах было показано, что именно 5'-фланкирующие последовательности гена ПОМК крысы отвечают за чувствительность промотора к глюкокортикоидам в передней доле гипофиза. Причем такая чувствительность промотора не наблюдалась в меланотрофах промежуточной доли гипофиза, как это имеет место и в случае эндогенного (мышиного) гена ПОМК ( Tremblay Y. ea, 1988 ). Сайт связывания глюкокортикоидного рецептора (GR), необходимый для репрессии гена ПОМК крысы глюкокортикоидами, локализован в проксимальном домене вокруг -63 н.п. позиции промотора ( Drouin J. ea, 1989 ). Было показано, что шесть сегментов гена ПОМК крысы, каждый 23-26 н.п. длиной, защищались очищенным глюкокортикоидным рецептором из печени крысы в экспериментах по футпринтированию с ДНКазой I, экзонуклеазой III и диметилсульфатом ( Drouin J. ea, 1987 ).
Три сайта связывания глюкокортикоидного рецептора были локализованны в 5'-фланкирующем районе с позициями центров -579, -146 и -63 н.п. Один внутри экзона 1 с позицией центра +64 н.п. и два остальных - в первом интроне (А) на позициях +1450 и +1900 н.п.( Drouin J. ea, 1987 ). Ранее было показано, что экзоны 2, 3 и интрон В гена ПОМК крысы не содержат сайтов связывания глюкокортикоидного рецептора ( Payvar F.P. ea, 1983 ). С помощью направленного мутагенеза и исследования воздействия глюкокортикоидов на экспрессию в линии клеток AtT-20 ПОМК-нео гибридных генов-маркеров, несущих тот или иной из шести выявленных сайтов связывания глюкокортикоидного рецептора (GR), было показано, что только один сайт с центром -63 н.п. необходим для ингибирования глюкокортикоидами экспрессии гена ПОМК крысы ( Drouin J. ea, 1989 ).
Необходимо отметить, что позитивная регуляция транскрипции глюкокортикоидами достаточно хорошо изучена.
Сайт связывания глюкокортикоидного рецептора (GR) в глюкокортикоид индуцируемых генах определен как глюкокортикоид ответственный элемент (GRE), и для него выведена консенсусная нуклеотидная последовательность 5'-GGTACANNNTGTTCT-3' ( Beato M., 1989 ). В случае промотора гена ПОМК крысы, -63 н.п. сайт связывания GR in vitro, или, так называемый, негативный глюкокортикоид ответственный элемент промотора (nGRE) существенно отличается от консенсуса GRE ( Drouin J. ea, 1989 ; Drouin J. ea, 1993 ; Drouin J., 1993 ; Drouin J. ea, 1990 ) и не содержит некоторых очень консервативных нуклеотидов, присутствующих в GRE элементах ( Beato M., 1989 ).
Когда важность нуклеотидных отличий между nGRE и GRE была проверена напрямую сайт-направленным мутагенезом, превращающим nGRE в последовательность, удовлетворяющую консенсусу GRE, было найдено, что промотор ПОМК становился глюкокортикоид индуцибельным ( Drouin J. ea, 1993 ). Таким образом, отличия в нуклеотидной последовательности nGRE являются важным фактором, определяющим эффект воздействия глюкокортикоидного рецептора ( Therrien M. ea, 1993 ). Однако сам по себе негативный nGRE, например, включенный в состав гетерологичного промотора в виде олигонуклеотидов, содержащих только последовательность nGRE, не придает промотору свойств гормон-зависимой репрессии ( Drouin J. ea, 1993 ). Более того, nGRE олигонуклеотиды лишены вообще какой либо активности, будучи встроенными в MTV промотор, вычлененный из своих гормон- чувствительных последовательностей ( Drouin J. ea, 1993 ). Таким образом, nGRE не ведет себя подобно элементу-заглушке, способному репрессировать транскрипцию в любом окружении.
Исследование комплексов, формируемых очищенным рецептором GR из печени крысы с nGRE и GRE ДНК зондами показало, что последовательность nGRE связывает три молекулы рецептора ( Drouin J. ea, 1993 ), в то время как зонды консенсуса GRE связывают гомодимер рецептора ( Beato M., 1989 ). Оказалось, что nGRE элемент промотора формирует комплекс с молекулами рецептора, связывая сначала гомодимер GR=GR на одной стороне двойной спирали ДНК, а затем кооперативно связывая третью молекулу GR рецептора с противоположной стороны двойной спирали ДНК ( Drouin J. ea, 1993 ; Drouin J., 1993 ; Therrien M. ea, 1993 ). То есть образуется сэндвич из нуклеотидной последовательности nGRE и трех глюкокортикоидных рецепторов.
Промотор ПОМК с двойными мутациями в последовательности nGRE (G нуклеотидные остатки в позициях 1 и 2, или в позициях 5 и 6), приводящими к потере nGRE элемента способности образовывать тройные комплексы, больше не репрессировал транскрипцию как интактный ( Drouin J. ea, 1993 ). Таким образом, нуклеотидная последовательность nGRE ПОМК, существенно отличающаяся от консенсуса GRE, связывает глюкокортикоидный рецептор в совершенно другой комплекс ( Therrien M. ea, 1993 ). Формирование такого тримолекулярного комплекса коррелирует со способностью последовательности опосредовать репрессию транскрипции ( Drouin J. ea, 1993 ; Drouin J., 1993 ).
Однако рецептор зависимая репрессия не обусловлена вытеснением положительного транскрипционного фактора, который мог бы связываться с последовательностью nGRE элемента, потому что мутации в этой последовательности не влияют на базальный уровень транскрипции гена ПОМК ( Therrien M. ea, 1993 ). Поскольку nGRE район промотора гена ПОМК почти-что единственный лишен последовательностей, определяющих базальную транскрипционную активность ( Therrien M. ea, 1991 ), Drouin J. предполагает, что связывание рецептора в проксимальном (ближнем к старту транскрипции) районе промотора гена ПОМК мешает действию других транскрипционных факторов, связывающихся выше и/или ниже GR рецептора. Это могло бы происходить за счет образования стерических препятствий ( Therrien M. ea, 1993 ; Drouin J., 1993 ).
С другой стороны, связанный с ДНК рецептор мог бы быть помехой эффективной транскрипции, изменяя или ограничивая локальную конформацию ДНК в проксимальном районе промотора, который содержит последовательность nGRE. То есть, связывание nGRE с каждой стороны двойной спирали может ограничивать конформацию этой ДНК и, таким образом, препятствовать взаимодейиствию между связанными выше факторами и основной транскрипционной машиной, связанной с TATA-боксом ( Therrien M. ea, 1993 ; Drouin J., 1993 ; Drouin J., 1994 ).
