ПОМК крысы: сайты связывания ядерных белков в области промотора
Детальный анализ нуклеотидных последовательностей доменов промотора в экспериментах по футпринтированию с ДНКазой I и ядерными экстрактами линии клеток AtT20 обнаружил десять сайтов связывания in vitro ядерных белков внутри промотора. Четыре в проксимальной части промотора - PE1-PE4, два в центральной - CE1 и CE2 и четыре в дистальной - DE1-DE4 ( Therrien M. ea, 1993 ). Из них, по крайней мере, девять являются регуляторными элементами ( Therrien M. ea, 1991 ). Причастность этих сайтов к функционированию промотора гена ПОМК была проверена исследованием различных делеционных мутантов промотора, слитого c репортерным геном люциферазы овода. Мутации в важных для активности промотора элементах приводили к пониженной активности промотора в составе гибридных конструкций ( Therrien M. ea, 1991 ).
Ядерные белки клеток AtT20 , узнающие эти регуляторные элементы, были в дальнейшем охарактеризованы методами конкурентного связывания и задержки в геле, в которых каждый элемент брался и как зонд и как конкурентная ДНК для того, чтобы определить, могут ли одни и те же ядерные белки связывать более чем один элемент промотора. Хотя природа многих ядерных белков, связывающихся с промотором гена ПОМК, оказалась неизвестна, выяснилось, что часть из них - известные транскрипционные факторы, другие - являются родственниками ранее описанных факторов транскрипции. Так транскрипционный фактор AP-1 ( белок активатор 1 клеток HeLa ) связывается с нижней половиной (3'-частью) элемента PE1, а верхняя половина (5'-часть) этого же элемента PE1 является сайтом связывания in vitro транскрипционного фактора COUP ( фактор транскрипции раннего промотора овальбумина цыпленка ) ( Therrien M. ea, 1991 ; Therrien M. ea, 1993 ).
В то время как ядерные экстракты клеток AtT20 содержат белки, которые связывали эти две последовательности элемента PE1 в разных условиях, экстракты, приготовленные из тканей передней доли гипофиза крысы, могут связывать обе последовательности одновременно, т.е. при одинаковых условиях. Эти различия между экстрактами клеток AtT20 и гипофиза могут объясняться наличием в них разных членов семейства AP-1 и/или COUP транскрипционных факторов. Поскольку мутации замещения, перекрывающие либо AP-1, либо COUP последовательности PE1 элемента, снижали активность промотора, они обе могут быть активны in vivo ( Therrien M. ea, 1991 ). COUP фактор транскрипции связывается in vitro также с элементом PE3, и этот сайт связывания перекрывается с сайтом связывания in vitro глюкокортикоидного рецептора (GR) ( Drouin J. ea, 1990 ). Роль PE3 элемента и сайта связывания COUP, который является его частью, пока не ясна, т.к. мутации замещения этой последовательности не влияли на базальный уровень активности промотора ПОМК при экспрессии в клетках AtT20. Вполне вероятно, что элемент PE3 может быть неактивен в кортикотрофных клетках (по крайней мере в клетках гипофизарной опухоли грызунов AtT20), но может проявлять свою активность в других экспрессирующих проопиомеланокортин тканях, таких, как меланотрофные клетки промежуточной доли гипофиза или гипоталамические нейроны ( Therrien M. ea, 1993 ).
Элементы PE4 и CE1 узнаются in vitro белками, которые оказались родственными, но отличными от транскрипционного фактора Sp1 ( Therrien M. ea, 1991 ). Остальные регуляторные элементы не узнавались легко идентифицируемыми факторами транскрипции, но все они были необходимы для активности промотора гена ПОМК. Нуклеотидные последовательности ДНК обуславливающие клеточно-специфичное опознавание промотора гена ПОМК локализованы в центральном и дистальном доменах ( Therrien M. ea, 1993 ).
