ПОМК крысы: структура и активность доменов промоторной области
Трансфекция химерных конструкций с доменами промотора ПОМК в клетках, которые экспрессируют (AtT20) и не экспрессируют (GH3 и L) ПОМК, показала, что синергичная активность дистального и центрального доменов специфична для клеток AtT20, в то время как проксимальный домен имеет одинаковую активность во всех трех линиях клеток. Центральный домен сам по себе не придает химерным конструкциям свойство клеточной специфичности. Анализ элементов дистального домена показал, что DE2 элемент полностью отвечает за клеточно-специфичную синергичную активность промотора гена ПОМК крысы. Более детальный анализ DE2 выявил сложную организацию этого дистального элемента, которая включает три активные последовательности ( Therrien M. ea, 1993 ).
Подэлемент DE2A состоит из AT-богатой последовательности, которая узнается ядерными белками клеток AtT20 при футпринтинге ( Therrien M. ea, 1991 ). Подэлементы DE2B и DE2C содержат E-бокс мотив, 5'-CANNTG-3' ( Murre C. ea, 1989 ), типичный для сайтов связывания транскрипционных факторов семейства HLH (Helix-Loop-Helix). Все три подэлемента участвуют в активности DE2 домена, но подэлемент DE2C наиболее активен. Причем интересно, что E-бокс мотив DE2C не может быть заменен другими (неидентичными) Е-боксами, такими, как кЕ2 сайт гена иммуноглобулина или Е-бокс гена креатинин киназы ( Therrien M. ea, 1993 ). Структура подэлемента DE2C позволяет Drouin J. и соавторам предположить, что в механизм клеточно-специфичной транскрипции гена проопиомеланокортина могут быть вовлечены транскрипционные факторы семейства HLH (Helix-Loop-Helix) ( Therrien M. ea, 1993 ). Идентифицированные анализом сдвига в электрофоретической подвижности AtT20 ядерные белки, специфически узнающие DE2C подэлемент, были названы CUTE белки (белки связывающие ранний промоторный элемент в кортикотрофах - от английского corticotroph upstream transcription element binding). CUTE белки специфичны только для клеток AtT20 и имеют картину DMS футпринтинга и специфичность связывания ДНК, типичную для транскрипционных факторов семейства HLH. Кроме того, оказалось, что CUTE белки формируют гетеродимер с более вездесущим HLH фактором, родственным фактору транскрипции E12 человека, а этот комплекс (CUTE-фактор транскрипции) затем связывается с ДНК, что также типично для семейства HLH ( Therrien M. ea, 1993 ).
Такие гетеродимерные комплексы были обнаружены только в линии клеток AtT20, но не в линиях клеток HIT(инсулинома), GH3, L, Raji и L6, которые не экспрессируют ПОМК ( Therrien M. ea, 1993 ).
Таким образом было показано, что клеточно-специфичные транскрипционные факторы CUTE и их сайты связывания в промоторе гена ПОМК крысы являются важными элементами, определяющими клеточную специфичность этого промотора. Элемент центрального домена, отвечающий за клеточно- специфичное и синергическое узнавание промотора гена проопиомеланокортина крысы в клетках AtT20 пока не установлен.
