Более высокие уровни организации хроматина: часть 2
Значительные споры имели место по вопросу о деталях того, каким образом организована 30-нанометровая фибрилла хроматина. В целом были описаны либо "соленоидные" (одностартовая спираль) модели, в которых нуклеосомы постепенно сворачиваются вокруг центральной оси (6-8 нуклеосом на один оборот), либо более открытые модели типа "зигзага", предполагающие самосборку более высокого порядка (двухстартовая спираль). Новые данные, в том числе данные рентгеноструктурного анализа с использованием модельной системы, содержащей четыре нуклеосомы, позволяют предполагать такую организацию фибриллы, которая в большей мере согласуется с двухстартовой, зигзагообразной конформацией линкерной ДНК, соединяющей две стопки нуклеосомных частиц ( Khorasanizadeh, 2004 ; Schalch et al., 2005 ). Несмотря на этот прогресс, следует отметить, что линкерный гистон не присутствует в действительно существующих [current] структурах и даже если бы он там присутствовал, 30-нанометровая хроматиновая фибрилла компактизирует ДНК всего лишь примерно в 50 раз.
Таким образом, в организации хроматина существует значительно больше уровней более высокого порядка, которые еще предстоит различить за рамками свето- и электронно-микроскопического исследования и которые обусловливают либо интерфазное, либо митотическое состояния хроматина.
Результаты, полученные на живых клетках, несмотря на некоторую структурную неопределенность, уже выявили в интерфазных хромосомах существование множественных уровней сворачивания хроматина выше уровня 30-нанометровой фибриллы. Заслуживающим внимания достижением было развитие новых подходов, позволяющих метить специфические нуклеотидные последовательности ДНК в живых клетках, что создает возможность изучать динамику "открытия" и "закрытия" хроматина in vivo в реальном времени. Интересно, что эти результаты выявляют динамическое взаимодействие позитивных и негативных факторов ремоделинга хроматина в установлении хроматиновых структур более высокого порядка для состояний, в большей или меньшей мере совместимых с экспрессией генов ( Fisher and Merkenschlager, 2002 ; Felsenfeld and Groudin, 2003 ; Misteli, 2004 ).
Имеет место организация в более крупные петлевидные хроматиновые домены (300-700 нм), возможно путем заякоривания хроматиновой фибриллы на периферии ядра или на других ядерных скаффолдах (остовах) с помощью таких ассоциированных с хроматином белков, как ядерные ламины . Остается неясным, в какой степени эти ассоциации дают начало значимым [meaningful] "хромосомным территориям", но многочисленные сообщения показывают, что эта концепция заслуживает серьезного внимания. Например, наблюдали образование кластеров множественных сайтов активного хроматина с транскрипционными факторами РНК-полимеразы II (RNA pol II); аналогичные концепции, по-видимому, приложимы к образованию кластеров вокруг реплицирующейся ДНК и ДНК-полимеразы. Напротив, образование кластеров "молчащего" гетерохроматина (в особенности перицентромерных фокусов) и генов, локализованных в trans- положении, также было документировано. Каким образом эти ассоциации контролируются и насколько ядерная локализация хроматиновых доменов затрагивает регуляцию генома - еще не ясно. Тем не менее, все большее количество данных показывает наличие корреляций активной или "молчащей" конфигурации хроматина с определенной ядерной территорией ( Cremer and Cremer, 2001 ; Gilbert et al., 2004 ; Janicki et al., 2004 ; Chakalova et al., 2005 ).
Наиболее конденсированная структура ДНК наблюдается на стадии метафазы митоза или мейоза. Это делает возможным надежное расхождение, с помощью хромосом, точных копий нашего генома (одной или двух копий каждой хромосомы, в зависимости от наблюдаемого типа деления) в каждую дочернюю клетку Эта конденсация связана с серьезным реструктурированием ДНК из состояния двухметровой, полностью растянутой молекулы в состояние дискретных хромосом размером в среднем 1,5 мкм в диаметре ( рис. 3.7 ). Это не меньше, чем 10000-кратная компактизация и она достигается путем гиперфосфорилирования линкерного (H1) и корового гистона НЗ и зависящего от АТФ действия конденсиновых и когезиновых комплексов и топоизомеразы II. Остается еще определить, как конкретно негистоновые комплексы затрагивают митотический хроматин (или модификации хроматина фазы М) и по каким правилам происходит (зависимым от клеточного цикла образом) их ассоциация с хроматином и высвобождение из него ( Bernard et al., 2001 ; Watanabe et al., 2001 ). Здесь может оказаться важным хорошо известное митотическое фосфорилирование гистона НЗ (т.е. серинов 10 и 28) и членов семейства H1, но полного понимания того, в чем заключается функция этих митотических меток, предстоит еще достичь в генетических и биохимических экспериментах. Интересно, что была предложена формальная теория, согласно которой специфические метки, обусловленные метилированием, при сочетании с более динамичными и обратимыми метками, обусловленными фосфорилированием, могут действовать в гистоновых белках как "двоичный переключатель", управляя связыванием и высвобождением эффекторов, находящихся "вниз по течению" и затрагивающих хроматиновую матрицу ( Fischle et al., 2003а ). Используя связывание НР1 с метилированным по лизину 9 гистоном НЗ (НЗК9mе) и митотическое фосфорилирование серина 10 ( H3S10ph ), недавно получили данные в поддержку митотического "метил/фос-переключателя" ( Daujat et al., 2005 ; Fischle et al., 2005 ; Hirota et al., 2005 ).
Такие специализированные хромосомные домены, как теломеры и центромеры, выполняют другие функции, направленные на динамику хромосом как таковую. Теломеры действуют как хромосомные концы, обеспечивая защиту и уникальное решение проблемы репликации самых кончиков молекул ДНК. Центромеры обеспечивают места прикрепления для микротрубочек веретена во время деления ядра. Оба этих специализированных домена играют фундаментальную роль в событиях, приводящих к надежному расхождению хромосом. Интересно, что и теломерный, и центромерный гетерохроматин отличается от эухроматина и даже других гетерохроматиновых районов присутствием уникальных хроматиновых структур, которые в основном оказывают репрессивное действие на активность генов и рекомбинацию. Перемещение экспрессируемых генов из их нормального положения в эухроматине в новое положение в центромерном и теломерном гетерохроматине или поблизости от него может заставить эти гены "замолчать", создавая возможность скрининга для поиска и идентификации супрессоров или энхансеров эффекта положения мозаичного типа ( PEV ) или эффектов прителомерного положения ( ТРЕ , telomere-position effects; Gottschling et al., 1990 ; Aparicio et al., 1991 ). Центромеры и теломеры имеют молекулярные сигнатуры, в том числе, например, гипоацетилированные гистоны. Интересно, что центромеры "маркированы" также присутствием гистонового варианта CENP-A , играющего активную роль в сегрегации хромосом. Таким образом, правильная сборка и поддержание различающихся центромерного и перицентромерного гетерохроматина являются критичными для завершения митоза или мейоза и, отсюда, для жизнеспособности клеток.
В дополнение к хорошо изученным центромерной и перицентромерной формам конститутивного гетерохроматина успешно исследуются механизмы эпигенетического контроля центромерной (и теломерной) "идентичности". Остроумными экспериментами удалось показать, что вместо нормальных центромер могут функционировать "неоцентромеры", демонстрируя тем самым, что идентичность центромер не диктуется нуклеотидными последовательностями ДНК. Вместо этого данный специализированный хромосомный домен маркируют эпигенетические особенности [hallmarks], в том числе паттерны специфичных для центромер модификаций и варианты гистонов.
В вопросе о том, каким образом другие кодирующие, некодирующие и повторяющиеся участки хроматина вносят свой вклад в эти эпигенетические сигнатуры, достигнут значительный прогресс. Как те или иные из этих механизмов соотносятся (если соотносятся вообще) с паттернами бэндинга хромосом - неизвестно, но остается интригующей возможностью. Необходимо достичь понимания того, как эпигенетически регулируются эти части уникальных хромосомных районов, особенно в свете того, что многочисленные виды рака у человека характеризуются геномной нестабильностью, которая является маркером прогрессии некоторых заболеваний и неоплазии.
