Дифференцировка донорской клетки и эффективность репрограммирования
Состояние дифференцировки донорской клетки и эффективность репрограммирования ядра.
Вопрос, уже возникавший в плодотворных экспериментах по клонированию у амфибий, заставлял предполагать наличие обратной зависимости между состоянием клеточной дифференцировки донорского ядра и его способностью направлять развитие после пересадки в яйцеклетку ( рис. 22.3 ). Важно было выяснить, влияет ли состояние дифференцировки донорской клетки на эффективность репрограммирования и у млекопитающих. Как показано в табл. 22.2 , репрограммирование можно измерить функционально, оценив развитие клонов на нескольких разных уровнях, включая
- 1) скорость формирования бластоцисты после пересадки ядра в яйцо,
- 2) долю клонированных эмбрионов, выживающих до рождения или до взрослого состояния после имплантации в матку, и
- 3) частоту, с которой из клонированных бластоцист , эксплантированных в культуру, можно получить плюрипотентные эмбриональные стволовые клетки ( ES-клетки ).
Эффективность предимплантационного развития реконструированных ооцитов в бластоцисты особенно чувствительна к таким экспериментальным параметрам, как стадия клеточного цикла и физическое состояние пересаживаемого ядра. Например, клонирование неделящихся донорских клеток более эффективно, чем клонирование активно пролиферирующих клеток ( Campbell et al., 1996а ; Cibelli et al., 1998 ). Так, как и ожидалось из этого отношения, яйцеклетки, реконструированные с использованием донорских ядер из фибробластов , клеток Сертоли , кумулюса или клеток NKT , находящихся в фазе G, или G0 клеточного цикла, достигают стадии бластулы с относительно высокой эффективностью в противоположность клеткам ES или клеткам эмбриональной карциномы ( ЕС ), которые активно делятся и большая доля которых находится в фазе S ( табл. 22.2 ). Благодаря экспериментальной вариабельности в ходе дробления измерение доли бластоцист, полученных из реконструированных ооцитов , не является надежным критерием для количественной оценки "способности к репрограммированию". Однако, коль скоро клонированный эмбрион достиг стадии бластоцисты, после имплантации в матку его развитие до рождения зависит от состояния дифференцировки донорского ядра. Клонированные эмбрионы, полученные от таких эмбриональных доноров, как клетки ES или ЕС, развиваются до рождения с эффективностью в 10-20 раз более высокой, чем эмбрионы, полученные от донорских клеток кумулюса или фибробластов ( Eggan et al., 2001 ; Wakayama and Yanagimachi, 2001 ), предположительно потому, что ядро недеференцированной клетки более склонно к репрограммированию или нуждается в нем в меньшей степени, чем ядро дифференцированной соматической клетки. Это указывает на обратное отношение между стадией дифференцировки донорской клетки и эффективностью репрограммирования. Наконец, коль скоро эмбрион достиг стадии бластоцисты, он с довольно существенной вероятностью может дать начало клеткам ES; это показывает, что получение клеток ES из эксплантированных бластоцист гораздо меньше зависит от состояния дифференцировки донорского ядра ( табл. 22.2 ).
