Модификация гистонов и сайленсинг гетерохроматина у Drosophila
Модификация гистонов играет ключевую роль в сайленсинге гетерохроматина.
Анализ SU(VAR)3-9 позволил идентифицировать ключевую функцию, необходимую для сайленсинга гетерохроматиновых генов ( Tschiersch et al., 1994 ). Этот белок содержит домен SET , функционирующий как фермент в метилировании НЗК9 гистонов . То, что этот белок является метилтрансферазой лизина гистонов ( НКМТ ), "нацеленной" на НЗК9, было впервые показано в ходе изучения гомологичного белка человека, SUV39H1 ( Rea et al., 2000 ). У Drosophila SU(VAR)3-9 является главной, но не единственной НКМТ НЗК9 ( Schotta et al., 2002 ; Ebert et al., 2004 ). SU(VAR)3-9 контролирует диметилирование H3K9 в основной массе перицентромерного гетерохроматина, но не в четвертой хромосоме, теломерах или эухроматиновых сайтах. Триметилирование НЗК9, которое у Drosophila наблюдется, главным образом, во внутреннем хромоцентре, также контролируется SU(VAR)3-9. Диметилирование этого внутреннего района не зависит от SU(VAR)3-9, как и монометилирование НЗК9 в перицентромерном гетерохроматине ( Ebert et al., 2004 ). HKMTs, ответственные за эти модификации, все еще неизвестны. Важное значение диметилирования НЗК9 в сайленсинге гетерохроматиновых генов демонстрируется сильным зависящим от дозы влиянием SU(VAR)3-9 на PEV , атакже тем фактом, что супрессия сайленсинга генов мутациями Su(var)3-9 коррелирует с активностью их НКМТ. Ферментативно гиперактивная мутация Su(var)3-9ptn является сильным энхансером PEV и вызывает повышенное содержание НЗК9me2 и НЗК9meЗ в хромоцентре, а также порождает заметные сигналы НЗК9me2 во многих эухроматиновых сайтах (эктопический гетерохроматин). S-Аденозилметионин функционирует как донор метальной группы для всех этих реакций метилирования; следовательно, мутации в гене, кодирующем S-аденозилметионинсинтазу, Su(z)5 , являются доминантными супрессорами PEV ( Larsson et al., 1996 ).
Исследования с использованием генов Su(var) начали вскрывать последовательность молекулярных реакций, необходимых для установления гетерохроматиновых доменов. Связывание SU(VAR)3-9 в гетерохроматиновых нуклеотидных последовательностях зависит как от его хромодоменов, так от SET-доменов ( Schotta et al., 2002 ). Как контролируется SU(VAR)3-9 - все еще неизвестно. Метилирование НЗК9 белком SU(VAR)3-9 устанавливает сайты связывания для НР1 . Хромодомен НР1 специфически связывается с НЗК9me2 и НЗК9meЗ ( Bannister et al., 2001 ; Lachner et al., 2001 ). Что SU(VAR)3-9 связывается с HP1, было показано двугибридными тестами на дрожжах [yeast two-hybrid tests] и иммунопреципитацией ( Schotta et al., 2002 ). Район SU(VAR)3-9, аминотерминальный по отношению к его хромодомену, взаимодействует с доменом "chromoshadow" НР1 . Этот район SU(VAR)3-9 взаимодействует также с карбокситерминальным доменом SU(VAR)3-7 . SU(VAR)3-7 взаимодействует в трех разных сайтах с доменом "chromoshadow" НР1 ( Delattre et al., 2000 ). При таком паттерне взаимодействий можно предположить, что эти три белка - НР1, SU(VAR)3-7 и SU(VAR)3-9 - физически связаны в мультимерных белковых комплексах гетерохроматина.
Ассоциация SU(VAR)3-9 и НР1 с перицентромерным гетерохроматином является взаимозависимой ( Schotta et al., 2002 ). SU(VAR)3-9 вызывает диметилирование НЗК9, который специфически узнается хромодоменом НР1 ( Bannister et al., 2001 ; Lachner et al., 2001 ). Следовательно, у личинок нуль-Su(var)3-9 связывание НР1 с перицентромерным гетерохроматином нарушено ( рис. 5.4 ,б). Это отражает специфическую активность НР1, который связывается с НЗК9me2 , но не с H3K9me1 ; SU(VAR)3-9 не затрагивает монометилирование ( Ebert et al., 2004 ). Диметилирование НЗК9 во внутреннем хромоцентре, четвертой хромосоме в теломерах и в эухроматиновых сайтах не зависит от SU(VAR)3-9, и, следовательно, в мутантных линиях НР1 продолжает обнаруживаться во всех этих сайтах. В клетках дикого типа SU(VAR)3-9 связывается с этими сайтами, но, по- видимому, неактивен; неизвестная НКМТ контролирует метилирование НЗК9 в этих районах.
Напротив, если НР1 не присутствует (устранен мутациями), SU(VAR)3-9 больше не связывается с перицентромерным гетерохроматином, но обнаруживается также по длине эухроматиновых хромосомных плечей ( рис. 5.4 б). Теперь он виден почти во всех бэндах, где он вызывает эктопическое моно- и диметилирование НЗК9 H3K9me1 и НЗК9me2 ( рис. 5.5 ). Таким образом, НР1 существен для ограниченного связывания SU(VAR)3-9 с перицентромерным гетерохроматином.
Эти данные позволяют представить себе последовательность реакций, начинающуюся со связывания SU(VAR)3-9 с гетерохроматиновыми доменами и последующего образования НЗК9me2 . Эта метка распознается хромодоменом НР1; связывание SU(VAR)3-9 с доменом "chromoshadow" белка НР1 обеспечивает его ассоциацию с гетерохроматином. Был создан химерный белок НР1-РС, в котором хромодомен НР1 был заменен хромодоменом белка Polycomb (PC) ( Platero et al., 1996 ). Хромодомен PC прочно связывается с H3K27me3 ( Fischle et al., 2003 ). Химерный белок HP1-PC узнает, следовательно, сайты связывания H3K27me3 Polycomb в эухроматиновых плечах; в присутствии такого химерного белка НР1-РС белок SU(VAR)3-9 также обнаруживается в сайтах связывания PC, демонстрируя свою сильную связь с доменом "chromoshadow" белка НР1 ( Schotta et al., 2002 ).
В клетках нуль-SU(VAR)3-9 сильно уменьшено содержание еще одной гетерохроматин-специфичной метки метилирования - триметилирования Н4К20 ( Н4К20meЗ ) ( Schotta et al., 2004 ). Было показано, что взаимозависимость между диметилированием НЗК9 и триметилированием Н4К20 отражает взаимодействие между белками SU(VAR)3-9, НР1 и SUV4-20. SUV4-20 является НКМТ , контролирующей метилирование Н4К20 в гетерохроматине. Это гетерохроматин-специфичная метка метилирования сильно ослаблена в нуль-клетках по SU(VAR)3-9, как и по НР1 , заставляя предполагать ассоциацию SU(VAR)3-9, НР1 и SUV4-20 в комплекс взаимно зависимых белков. Мутации в гене Suv4-20 вызывают сильную супрессию индуцированного PEV сайленсинга генов, показывая, что для этого процесса требуется метка Н4К20meЗ .
Третья метка метилирования гистонов, функционально связанная с формированием гетерохроматина, - это метилирование НЗК27, катализируемое НКМТ E(Z). У Drosophila E(Z) контролирует все моно-, ди- и триметилирование НЗК27 и в эухроматине, и в гетерохроматине. Следовательно, в нуль-клетках по E(z) все метилирование НЗК27 утрачивается ( Ebert et al., 2004 ). На функцию метилирования НЗК27 в сайленсинге гетерохроматиновых генов указывает как Su(var)-эффект мутаций E(z) типа утраты функции, так и энхансерный эффект дополнительных копий гена E(z) ( Laible et al., 1997 ). Неясно, является ли этот эффект прямым или косвенным. Метилирование НЗК27 является критическим для системы сайленсинга Polycomb , которая действует в эухроматиновых доменах. Между паттернами распределения и функциональными ролями PC и НР1 наблюдается относительно небольшое перекрывание. Каким образом могла бы осуществляться подгонка метилирования НЗК27 к зависимым от НР1 гетерохроматиновым комплексам - еще предстоит выяснить. Белок НР1 выполняет центральную линкерную функцию в формировании гетерохроматина и ассоциированном сайленсинге генов, связывании НЗК9me2 и НЗК9meЗ и взаимодействии непосредственно с SU(VAR)3-9 и несколькими дополнительными белками. Учитывая число идентифицированных локусов Su(var), эта модель определенно становится более сложной. У млекопитающих и растений метилирование НЗК9 гистонов и метилирование ДНК представляют взаимосвязанные метки репрессированного хроматина ( Martienssen and Colot, 2001 ; Bird, 2002 ). Происходит ли вообще метилирование ДНК у Drosophila или нет, многие годы было предметом полемики. Сообщения о низком уровне метилирования ДНК у ранних эмбрионов вновь подогрели эту дискуссию ( Kunert et al., 2003 ). Анализ генома показывает, что единственная имеющаяся различимая ДНК-метилтрансфераза - это Dnmt2 . Мутации в этом гене мало влияют на организм. Тем не менее, его роль в раннем эмбриогенезе исключать нельзя.
