Процедуры пересадки ядер: млекопитающие
Самые ранние попытки клонировать млекопитающих были выполнены с эмбрионами кроликов. В этих экспериментах ооциты сливали с клетками, взятыми от эмбрионов на стадии морулы , и было видно, что получающиеся в результате этого триплоидные клоны проделывали несколько делений дробления ( Bromhall, 1975 ). В 1984 году МакГрат и Солтер применили слияние с помощью вируса Сендаи для эффективной пересадки донорских ядер в денуклеированные зиготы. Этот метод был использован для экспериментов двух типов:
- 1) получают однородительские эмбрионы, замещая мужской пронуклеус женским (что дает начало гиногенетическому зародышу) или замещая женский пронуклеус мужским (что дает начало андрогенетическому эмбриону) ( McGrath and Solter, 1984а , McGrath and Solter, 1984b ; Surani et al., 1984 ). Однородительские эмбрионы не развиваются и неизменно погибают, давая первое доказательство того, что нормальное развитие млекопитающих критическим образом зависит от родительски- специфичного геномного импринтинга .
- 2) Клонированные эмбрионы были получены путем пересадки ядер от эмбрионов-доноров, находящихся на стадии дробления, в денуклеированные зиготы. Ни один из таких реконструированных эмбрионов не развивался дальше поздней стадии дробления, из чего следует, что тотипотентность генома в ходе раннего развития быстро утрачивается и что клонирование млекопитающих, в противоположность амфибиям, может быть невозможным ( McGrath and Solter, 1984b ). Однако результаты, полученные на других видах млекопитающих, вскоре поставили этот вывод под сомнение.
В 1986 году Вилладсену (Willandsen) удалось клонировать живых ягнят из ядер 4-16-клеточного эмбриона и вскоре после этого последовало создание клонированных телят и свиней ( Robi et al., 1987 ; Prather et al., 1989 ). Почему клонирование сельскохозяйственных животных оказалось успешным в противоположность хорошо контролируемым экспериментам по клонированию мышей ( McGrath and Solter, 1984b )? Основное различие в развитии этих видов животных заключается в сроках перехода от материнского контроля развития (на основе запасенной матерью РНК) к зиготическому контролю развития (на основе зиготически продуцируемой РНК). Этот основной переход, по-видимому, происходит на 8-16-клеточной стадии у овец и крупного рогатого скота ( Calarco and McLaren, 1976 ; Camous et al., 1986 ), но уже на 2-клеточной стадии у эмбрионов мышей ( Bolton et al., 1984 ). Таким образом, у клонируемых эмбрионов овец или коров временные ограничения для активации донорского генома могут быть менее жесткими, чем у клонируемых эмбрионов мышей, где для того, чтобы происходило дробление, донорское ядро должно быть активировано вскоре после пересадки.
Первым успешным получением клонированных животных путем пересадки ядра соматической клетки, а не пересадки ядра из клеток-доноров эмбриона на стадии дробления, было получение овцы из культивируемых фибробластов донора ( Campbell et al., 1996b ). За этим вскоре последовало создание " Долли " из донорского ядра клетки молочной железы ( Wilmut et al., 1997 ); "Долли" оказалась первым млекопитающим, клонированным из донорской клетки взрослого животного. С тех пор были клонированы всего 15 видов млекопитающих, в том числе мыши, козы, свиньи, коровы, кролики, крысы, кошки и собаки (обзор см. Campbell et al., 2005 ).
Процедура клонирования млекопитающего, как и клонирование амфибий, (см. " Процедуры пересадки ядер: амфибии ") включает два этапа. В большинстве, если не во всех успешных экспериментах по пересадке ядра соматической клетки, донорские ядра переносились в денуклеированные ооциты ( в отличие от ранних опытов по клонированию мышей, где донорское ядро от эмбриона на стадии дробления вводилось в денуклеированную зиготу; McGrath and Solter, 1984a ). На первом этапе пипеткой удаляли метафазное веретено яицеклетки-реципиента, вслед за чем в денуклеированное яйцо пересаживали донорское ядро. У большинства млекопитающих донорское ядро вводилось в яйцеклетку путем электрослияния с денуклеированным яйцом. У мышей яйцеклетки особенно легко повреждаются, и пересадка ядра у этого вида наиболее эффективна путем физического переноса донорского ядра в яйцо ( Wakayama et al., 1998 ). Как изображено на рис. 22.2 , донорское ядро вводится в денуклеированное яйцо с помощью пьезоэлемента, который облегчает проникновение через zona pellucida и цитоплазматическую мембрану ( Wakayama et al., 1998 ). Клонированные бластоцисты либо имплантируются в матку псевдобеременной приемной матери, чтобы получить клонированных мышей, либо эксплантируются в тканевую культуры, чтобы получить эмбриональные стволовые клетки от пересадки ядра ( NT-ES , nuclear transfer embryonic stem cells). Клетки NT-ES генетически идентичны донору и могут, следовательно, использоваться для "заказной" ("customized") клеточной терапии, называемой также " терапевтическим клонированием ".
