Эмбриональные стволовые (ЭС) клетки: методы дифференцировки
Одним из наиболее интересных и важных аспектов поведения линий ЭС клеток является их способность при воздействии соответствующего стимула дифференцироваться в культуре во множество зрелых типов соматических клеток, преимущественно через стадию клеток-предшественников. Самым обычным методом инициации дифференцировки является образование трехмерных сферических структур в суспензионной культуре, называемых эмбриоидными телами (ЭТ) , ввиду их сходства с постимплантационной эмбриональной тканью in vivo. Эти аггрегированные структуры содержат производные всех трех эмбриональных зародышевых слоев ( Abe и др., 1996 ; Leahy и др., 1999 ; Itskovitz-Eldor и др., 2000 ) и их формирование является предпосылкой для образования большинства типов зрелых соматических клеток, поскольку ЭС клетки, дифференцирующиеся в культуре в монослое, образуют большое количество эндодермальноподобных клеток, идентифицируемых по уплощению и шероховатому виду колоний. Следует, однако, заметить, что дифференцировка ЭТ не отображает всех стадий развития эмбриона, ибо не обладает ни полярностью, ни "планом строения тела". Поскольку это так, ЭС клетки не способны образовывать жизнеспособные эмбрионы. Образования ЭТ можно добиться множеством способов, применение которых следует за удалением LIF и/или фидерного слоя ( Keller, 1995 ). Клетки можно перенести в суспензионную культуру при высокой плотности ( Doetschman и др., 1995 ) или в среду, содержащую метилцеллюлозу ( Wiles и Keller, 1991 ) для образования ЭТ различных размеров и форм; существует альтернативный метод "висячей капли", обеспечивающий более контролируемое образование одиночных ЭТ из определенного количества клеток в индивидуальных каплях культуральной среды ( Wobus и др., 1991 ; Boheler и др., 2002 ). Время существования культуры ЭТ зависит от конечной цели (типа клетки), дифференцировка ЭТ хорошо коррелирует по времени с пост-имплантационным развитием эмбрионов ( Keller, 1995 ). Мезодермальные и эктодермальные предшественники образуются в течение нескольких дней, тогда как некоторые эндодермальные типы клеток могут потребовать более длительного времени культивирования (до 10 дней) до стадии, на которой большинство ЭТ образуют полости и становятся "пузырчатыми" ( Abe и др., 1996 ; Leahy и др., 1999 ).
Вслед за формированием ЭТ возвращают в условия прикрепленной культуры, при которых специализированные клетки продолжают развиваться. Неудивительно, что прогресс в управлении дифференцировкой in vitro мышиных ЭС клеток существенно больший, нежели для человеческих ЭС клеток.
