G-CSF (Г-КСФ): участки связывания с рецептором
В ранних исследованиях [ Kuga ea 1989 ] с помощью мутагенеза in vitro установлено, что большинство мутаций, локализованных во внутренней и С-концевой областях молекулы, нарушали активность Г-КСФ. Делеция десяти С-концевых остатков (165-174) также приводила к существенной потере биологической активности. Напротив, у мутантов без N-концевых четырех, пяти, семи или 11 АКО активность не изменялась. Однако данные о роли N-концевых АКО противоречивы, так как обнаружено [ Yamasaki ea 1998 ] и снижение биологической активности по мере увеличения N-концевой делеции по 11 АКО включительно. Получен модифицированный по N-концу Г-КСФ, белок KW-2228 , в котором Thr-1, Leu-3, Gly-4, Pro-5 и Cys-17 Г-КСФ дикого типа заменены на Ala, Thr, Туг, Arg и Ser, соответственно, и показано, что он обладает более высокой пролиферативной активностью, повышенными термо-стабильностью и устойчивостью в плазме крови при 37 С [ Kuga ea 1989 , Okabe ea 1990 , Suzuki ea 1992 ].
На основании эпитопного картирования молекулы Г-КСФ с помощью панели нейтрализующих моноклональных антител (моАТ) сделан вывод, что остатки 20-46 и СООН-конец участвуют в связывании с рецептором [ Layton ea 1991 ]. Сравнение кристаллических структур Г-КСФ человека, быка и собаки [ Lovejoy ea 1993 ], а также структуры и данных по мутагенезу гормона роста [ De ea 1992 , Wells ea 1993 ] позволило идентифицировать консервативные АКО, расположенные на поверхности Г-КСФ, и предсказать, что они могут формировать два сайта связывания с рецептором. О наличии двух активных сайтов свидетельствует также анализ полученной позднее более полной кристаллической структуры белка KW-2228 [ Fujii ea 1997 ].
Наиболее детальный структурно-функциональный анализ Г-КСФ впервые осуществлен в работе [ Reidhaar-Olson ea 1996 ] с помощью метода аланинсканирующего мутагенеза поверхностных АКО, позволяющего идентифицировать остатки, напрямую участвующие в функционировании белка [ Cunningham ea 1989 , Reidhaar-Olson ea 1988 ]. Эксперименты по определению пролиферативной и связывающей активностей 58 мутантов Г-КСФ позволили идентифицировать девять АКО, формирующих два сайта связывания с рецептором, из которых Lys40 и Phel44 в сайте 1 и Glul9 в сайте 2 наиболее значимы. Кроме того, Val48 и Leu49 в сайте 1 и Leul5, Aspl 12 и Leul24 в сайте 2 также важны для биологической активности и олигомеризации рецептора. Исследование теми же методами 28 мутантов Г-КСФ [ Young ea 1997 ] подтвердило, что в связывании с Г-КСФР участвуют пять заряженных АКО в спиралях А и С, наиболее важный из которых - Glul9, что соответствует сайту 2.
