G-CSFR (Г-КСФР) и Г-КСФ: модели лиганд-рецепторного комплекса
На основании полученных данных предложена следующая модель: при низких концентрациях лиганда (что соответствует равновесному состоянию гранулоцитопоэза in vivo) образуется асимметричный комплекс рецептор-лиганд со стехиометрией 2:1, а при высоких концентрациях (что соответствует гранулоцитопоэзу в экстремальных условиях, например, при инфекциях) -комплекс со стехиометрией 2:2 [ Horan ea 1997 , Horan ea 1996 ] или 4:4 [ Hiraoka ea 1994 ]. Такой зависимый от концентрации лиганда переход к комплексу более высокого порядка, в образовании которого участвует Ig-домен, принципиально отличается от взаимодействий с рецепторами, например, гормона роста [ Cunningham ea 1991 , De ea 1992 ] и эритропоэтина [ Syed ea 1998 ].
Гормон роста и эритропоэтин формируют со своими рецепторами симметричные комплексы рецептор-лиганд со стехиометрией 2:1, для чего достаточно только CRH-модуля.
Недавно с помощью ЯМР-спектроскопии определена третичная структура ВС-домена, что позволило предсказать участие петли F-G этого домена в узнавании лиганда ( рис. 4 ) [ Yamasaki ea 1997 ].
Осуществлено молекулярное моделирование активного сайта Г-КСФР [ Layton ea 1997 ] на основании сравнения известных последовательностей рецептора гормона роста и белка gp130 (субъединица рецептора ИЛ-6, ответственная за передачу сигнала) [ Wells ea 1996 ], а также третичной структуры рецептора гормона роста [ De ea 1992 ].
Аланинсканирующий мутагенез консервативных АКО предсказанного сайта связывания с лигандом и тестирование мутантных рецепторов по биологической активности и связыванию с Г-КСФ [ Layton ea 1997 ] позволили идентифицировать несколько АКО в CRH-модуле, формирующих сайт связывания, сходный с сайтом II рецептора гормона роста [ De ea 1992 ], из которых Arg288 в F-G-петле ВС-домена кажется наиболее важным. Для выявления АКО Г-КСФ, участвующих во взаимодействии с положительно заряженным остатком Arg288 рецептора, проведены аланинсканирующий мутагенез заряженных АКО, входящих в возможный сайт связывания 2 [ Reidhaar-Olson ea 1996 , Young ea 1997 ] и сравнение пролиферативной активности полученных мутантов на клетках, экспрессирующих рецептор дикого типа и мутантный рецептор с заменой Arg288 на Ala [ Layton ea 1999 ]. Результаты этих экспериментов подтвердили наличие сайта связывания, включающего остатки Lys23, Asp и, особенно, Glu19 в А и С спиралях Г-КСФ, и Arg288 рецепторa (обозначен сайт II по аналогии с таковым гормона роста). Проведенный анализ гидрофобных АКО сайта I Г-КСФ [ Reidhaar-Olson ea 1996 ] и АКО, расположенных рядом с ним, показал, что Glu46 и в некоторой степени Phel44 могут участвовать во взаимодействии с Ig-доменом рецептора (обозначен сайт III).
Исследования по связыванию с Г-КСФ и биологической активности химерных рецепторов (gp130-Г-КСФР) и (Г-КСФ-gр130) также косвенно свидетельствуют о наличии двух сайтов связывания, димеризации рецептора и конформационных изменениях в Г-КСФ и/или Г-КСФР, необходимых для формирования активного комплекса. Полученные результаты позволили предложить модель лигандрецепторного комплекса (рис. 5). Согласно этой модели сначала Г-КСФ с помощью Glul9 и в некоторой степени Lys23 и Aspl 12 связывается с CRH-модулем рецептора (сайт II). Это приводит к конформационным изменениям как в Г-КСФ, так и в Г-КСФР, что обеспечивает взаимодействие Ig-домена второго рецептора с Glu46 и, возможно, N-концом спирали D молекулы Г-КСФ (сайт III), димеризацию Г-КСФР и формирование лигандрецепторного комплекса со стехиометрией 2 : 2 [ Layton ea 1999 ]. Однако для подтверждения представленной модели требуются дальнейшие исследования мутантов Г-КСФР по Ig-домену:
Определена кристаллическая структура комплекса Г-КСФ с CRH-модулем Г-КСФР [ Aritomi ea 1999 ]. CRH-модуль связывается с Г-КСФ посредством двух поверхностей, главная из которых формируется в комплексе Г-КСФ-CRH 1 : 1, а минорная - из взаимодействий между N-концевой областью Г-КСФ и ВС-доменом другого комплекса 1:1, соединяя два комплекса 1 : 1 в комплекс лиганд CRH со стехиометрией 2 : 2. Первичные структуры главной и минорной контактных поверхностей Г-КСФ и BN-, ВС-доменов рецептора см. на рис. 1 и 4, соответственно. Главная контактная поверхность комплекса формируется с помощью обширных полярных и ван-дер-ваальсовых взаимодействий между АКО спиралей А и С Г-КСФ и CRH-модулем, а также сетью водородных связей, образуемых, в частности, между АКО Glul9 (Г-КСФ) и Туг172 (BN-домен), Arg288 (ВС-домен), что согласуется с данными мутагенеза Г-КСФ [ Reidhaar-Olson ea 1996 , Young ea 1997 ] и рецептора [ Layton ea 1997 ] и в общем соответствует сайту II [ Layton ea 1999 ]. Минорная контактная поверхность формируется с помощью гидрофобных связей и ван-дер-ваальсовых взаимодействий, а также водородных связей, в частности, между Phe259 и Ser7, а также His260 и GLn11 ВС-домена и Г-КСФ, соответственно. АКО сайта I [ Layton ea 1999 ] не формируют никаких связей в полученном кристаллическом комплексе. Напротив, предполагается существование других контактов, которые могут участвовать в ассоциации с Ig-доменом. Получены также данные, свидетельствующие о важной роли структурных особенностей ориентации составляющих комплекса, что может иметь значение для связывания с Ig-доменом и специфической активации внутриклеточной области рецептора [ Syed ea 1998 ], и не предусматривается моделью, рассмотренной выше [ Layton ea 1999 ] (см. рис. 5 ]. И хотя представленная модель не является исчерпывающей, она все же отражает важную стадию последовательного формирования активного комплекса in vivo.
