Векторы интегрирующие
Bacillus subtilis - грамположительная непатогенная бактерия, многие штаммы которой используются в промышленности для производства биологически активных соединений и пищевых веществ. B. subtilis секретирует белки и пептиды. Большинство векторов для клонирования ДНК в клетках B. subtilis создано на основе плазмид других видов бацилл, а также Staphylococcus aureus и бактерий рода Streptococcus.
Основным свойством интегрирующих векторов является их способность стабильно встраиваться в геном клетки-хозяина. Это становится возможным благодаря наличию последовательностей нуклеотидов, гомологичных последовательностям геномной ДНК. В результате функционирования общей системы рекомбинации происходит объединение хромосомной и плазмидной ДНК интегрирующего вектора, которое приводит к стабильному включению всей векторной плазмиды в хромосому.
Примером интегрирующего вектора служит плазмида pFH7 B. subtilis ( рис. II.11,а ). Векторная плазмида содержит фрагмент ДНК умеренного бактериофага SPбета и после попадания в клетки B. subtilis, лизогенные по данному бактериофагу, эффективно интегрируется в профаг. Поскольку плазмида содержит ген устойчивости к хлорамфениколу cat , клетки приобретают этот признак. Индукция профага приводит к образованию фаговых частиц, трансдуцирующих плазмиду и ассоциированный с ней признак устойчивости к хлорамфениколу. Интеграция плазмиды SPбета в бактериальную хромосому происходит по механизму гомологичной рекомбинации с участием гена recE .
Способность к интеграции в бактериальную хромосому обнаруживают и другие плазмиды, содержащие фрагменты хромосомной ДНК клеток-хозяев, что продемонстрировано, в частности, для плазмид E. coli и Streptococcus pneumoniae.
Интегрирующие векторные системы, в которых используется принцип гомологичной рекомбинации, разработаны и для эукариотических клеток. Такие работы привели к развитию исследований по созданию трансгенных животных и растений .
Наличие феномена гомологичной рекомбинации между хромосомной ДНК клетки-хозяина и векторной ДНК, содержащей гомологичные хромосомной ДНК последовательности нуклеотидов, приходится учитывать при получении соответствующих генно-инженерных конструкций. Такая неконтролируемая рекомбинация может приводить к потере или структурным перестройкам клонированных фрагментов ДНК. Для того, чтобы свести последствия этого явления к минимуму, используют штаммы клеток-хозяев, в которых общая система рекомбинации не функционирует, например, вследствие мутационной инактивации гена recA E. coli или recE B. subtilis .
