ДНК- и РНК-Лигазы в генной инженерии
Создание фосфодиэфирных связей в одноцепочечных разрывах двухцепочечной ДНК с помощью ДНК-лигаз является наряду с рестрикцией одним из важнейших этапов получения рекомбинантных ДНК in vitro.
Наибольшее применение в генно-инженерных исследованиях находит ДНК-лигаза бактериофага Т4 . Реакция лигирования протекает в два этапа ( рис. II.3 ). Вначале образуется промежуточный комплекс фермент-АМР (этап 1), после чего остаток АМР переносится на 5'-фосфатную группу концевого нуклеотида в точке разрыва ДНК (этап 2). Образовавшаяся фосфодиэфирная связь гидролизуется во время нуклеофильной атаки 3'-ОН группы соседнего нуклеотида, что приводит к образованию новой фосфодиэфирной связи, восстанавливающей целостность сахаро-фосфатного остова ДНК. Т4- ДНК-лигаза осуществляет соединение фрагментов двухцепочечной ДНК, обладающих комплементарными "липкими" или "тупыми" концами. Необходимым условием протекания лигирования является наличие 5'- концевого фосфата и 3'-концевого гидроксила в точках разрыва цепей ДНК. При этом эффективность соединения фрагментов ДНК по "тупым" концам Т4-ДНК-лигазой возрастает в присутствии Т4-РНК- лигазы, которая осуществляет ковалентное соединение 5'- фосфорилированных концов одноцепочечных ДНК или РНК с 3'-ОН группами одноцепочечных нуклеиновых кислот.
