Клонотеки генов: введение рекомбинантных ДНК в клетки
После завершения лигирования векторных молекул с клонируемыми фрагментами ДНК реакционную смесь с продуктами реакции уже можно рассматривать как библиотеку генов. Полученные таким образом рекомбинантные молекулы ДНК хранятся длительное время в замороженном состоянии, и по мере необходимости из них отбирают аликвоты реакционной смеси, содержащие требуемое количество рекомбинантных молекул, и вводят в клетки микроорганизмов для клонирования и дальнейшей работы.
Процесс поглощения экзогенной ДНК бактериальными клетками, сопровождающийся приобретением ими новых генетических маркеров, называют генетической трансформацией . В том случае, если бактериальные клетки поглощают ДНК бактериофагов и в результате происходит образование зрелых фаговых частиц, говорят о трансфекции фаговой ДНК . Поглощение экзогенной ДНК в процессе трансформации и трансфекции может осуществляться лишь компетентными клетками . Под компетентностью понимается такое состояние бактериальных клеток, при котором они способны сорбировать экзогенную ДНК на своей поверхности и поглощать ее, после чего экзогенная ДНК может быть интегрирована в бактериальную хромосому или существовать в виде внехромосомного элемента ( эписомы , плазмиды ).
Для многих грамположительных бактерий компетентность является естественным свойством, максимально выраженным на определенных этапах роста культуры. У грамотрицательных клеток E. coli естественная компетентность отсутствует и клетки приобретают ее лишь в искусственных условиях. Установлено, что при низких температурах и в присутствии двухвалентных катионов клетки E. coli и экзогенная ДНК продуктивно взаимодействуют друг с другом и экзогенная ДНК может с высокой эффективностью проникать внутрь бактериальных клеток. Частоту трансформации и трансфекции клеток E. coli можно повысить разными способами: тепловым шоком, введением в инкубационную смесь одновалентных катионов (Rb+), хлорида гексаминкобальта(III) или выращиванием на среде с повышенным содержанием ионов Mg2+ (10-20 мМ).
Методики трансформации бактериальных клеток позволяют получать до 107-108 трансформантов или трансфектантов на 1 мкг суперскрученной плазмидной ДНК. Поскольку трансформация и трансфекция проводятся при низких концентрациях экзогенной ДНК, а для появления у трансформированной бактерии устойчивости к антибиотикам или развития фаговой бляшки достаточно проникновения внутрь бактериальной клетки одной молекулы рекомбинантной ДНК, образовавшиеся колонии или бляшки трансформантов и трансфектантов содержат, как правило, только один тип рекомбинантных молекул ДНК с идентичными вставками клонируемых последовательностей нуклеотидов.
Более высокой эффективности трансформации (до 109-1010 трансформантов на 1 мкг ДНК) достигают при использовании электропорации. В этом случае клетки вместе с плазмидной или фаговой ДНК помещают в небольшую ячейку между двумя электродами и подвергают кратковременному (10-100 мкс) воздействию электрического поля высокой напряженности. Быстрая поляризация клеточных мембран приводит к образованию пор, сопровождаемому повышением проводимости и проницаемости для макромолекул. Происходит перенос экзогенных молекул ДНК внутрь клеток, подвергнутых электрическому шоку.
