Метод кассетного мутагенеза

Для получения необходимых фенотипических изменений требуется введение множественных мутаций в определенные участки гена с последующим отбором мутантов требуемого фенотипа. Для этого был разработан метод кассетного мутагенеза.

Из гена, клонированного в составе векторной плазмиды , по двум близко расположенным уникальным сайтам рестрикции вырезается фрагмент ДНК, в который необходимо внести мутации, и на его место встраивается синтетический двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий необходимые замены нуклеотидов (кассету мутаций). Если в окрестностях мутагенизируемого локуса гена отсутствуют подходящие природные сайты рестрикции, их вводят с помощью направленного мутагенеза.

Использование на определенных этапах синтеза вместо одного нуклеотида смеси из нескольких дезоксирибонуклеозидтрифосфатов позволяет получать за один прием сложную смесь олигонуклеотидов, которые могут содержать в определенных сайтах наборы кодонов для многих аминокислот. Это дает возможность осуществлять одновременный скрининг по искомому мутантному фенотипу большого числа разных мутантных клонов.

С помощью кассетного мутагенеза можно исследовать функциональную роль отдельных сайтов и целых доменов в полипептидных цепях конкретных белков и создавать рекомбинантные белки с новыми, подчас неожиданными свойствами.

Ссылки: