Метод поперечных сшивок
Важная информация о расположении индивидуальных рибосомных белков в составе рибосом получена с помощью метода поперечных сшивок.
Используя бифункциональные реагенты, например, диэпоксибутан или 2-иминотиолан, осуществляют ковалентное соединение рибосомных белков, расположенных по соседству на расстоянии 5-10 A друг от друга. Поскольку аминокислотные последовательности всех рибосомных белков известны, этим методом можно однозначно определять, какие аминокислотные остатки в соседних белках участвуют в образовании поперечных сшивок.
Целостность рибосом в водных растворах зависит от температуры и концентрации ионов Mg2+ и Ca2+. Понижение концентрации ионов Mg2+ приводит вначале к диссоциации рибосом на большую и малую субчастицы, а затем к последовательному упорядоченному освобождению рибосомных белков из субчастиц вплоть до их полного распада с образованием пула отдельных белков и рРНК. Процесс разборки рибосом обратим, и при восстановлении ионных и температурных условий в реакционной смеси возможно реконструирование рибосомных субчастиц из отдельных компонентов с образованием полноценных функционально активных рибосом. На рис. I.17 представлена карта сборки большой субчастицы рибосом E.coli из отдельных компонентов, которая отражает последовательность присоединения рибосомных белков к рРНК и два основных этапа сборки. Для перехода ко второму этапу необходимо дальнейшее изменение ионных условий и температуры реакционной среды. Процесс сборки субчастиц рибосом является кооперативным, т.е. присоединение одних рибосомных белков стимулирует включение других. При этом белки, включающиеся в состав рибосомных субчастиц друг за другом, в зрелых субчастицах оказываются расположенными рядом.
