Методы, основанные на обнаружении ошибочно спаренных нуклеотидов
Азотистые основания ДНК содержат реакционноспособные кето- и аминогруппы, которые можно легко модифицировать химическими методами. Основания, находящиеся в составе канонической двойной спирали ДНК, в большей степени защищены водородными связями от действия модифицирующих агентов, чем ошибочно спаренные основания в гетеродуплексах. Поэтому последние можно избирательно модифицировать химически.
В основном используют два подхода к обнаружению мутаций с помощью химических модификаций ошибочно спаренных оснований в гетеродуплексах. В первом подходе модификации подвергаются ошибочно спаренные остатки цитозина или тимидина с использованием соответственно гидроксиламина или четырехокиси осмия. После удаления из цепей анализируемых фрагментов ДНК неспаренных пиримидинов и расщепления депиримидинизированных остатков рибозы по фосфодиэфирным связям пиперидином образовавшиеся фрагменты ДНК исследуют с помощью электрофореза, что позволяет локализовать места расщепления цепей ДНК и соответственно положение мутантных нуклеотидов. Комбинированное использование этих методов дает возможность находить все теоретически возможные сочетания мутантных нуклеотидов.
При втором подходе используют водорастворимый карбодиимид для модификации ошибочно спаренных остатков G и Т. ДНК-полимераза прекращает элонгацию строящейся цепи ДНК вблизи модифицированного основания. В результате образуется укороченный гомогенный продукт реакции в виде вновь синтезированного фрагмента ДНК. Поэтому модифицированное основание (а следовательно, и мутация) может быть обнаружено посредством удлинения праймера Taq-полимеразой в присутствии радиоактивно меченных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов с последующим электрофоретическим определением размеров меченого продукта реакции.
Эффективность выявления мутаций с использованием химических модификаций ошибочно спаренных нуклеотидов приближается к 95%.
