Микроматрицы ДНК: кинетика гибридизации
Гибридизация в гетерогенных смесях нуклеиновых кислот происходит медленно. При использовании олигонуклеотидов в качестве зондов для ее завершения обычно требуется несколько часов, в случае зондов кДНК процесс продолжается в течение 6-24 ч при высокой температуре. Поиск зондом своей иммобилизованной мишени происходит двумя путями. Во-первых, может произойти прямая гибридизация непосредственно из раствора. Во-вторых, зонд вначале может неспецифически связаться с поверхностью подложки, диссоциировать из комплекса и, диффундируя вдоль поверхности, достичь мишени. Скорость гибридизации по второму механизму резко возрастает, когда длина зонда становится меньше 1000 нуклеотидов. Таким образом, время, необходимое для гибридизации, может быть уменьшено путем укорачивания молекулы зонда, повышения его концентрации в гибридизационных смесях и сокращения расстояния, которое необходимо преодолеть зонду до мишени путем диффузии.
Поскольку концентрация зондов в гибридизационных смесях ограничена их химическими свойствами, основным фактором, с помощью которого можно уменьшать время гибридизации и объем наносимого образца с зондом, становится плотность расположения пятен ДНК-мишеней (элементов) в микроматрицах. Размеры индивидуальных элементов микроматриц, получаемых фотолитографическими методами, лежат в пределах 5-10 мкм при общей их максимальной плотности на подложке около 106/см2. Плотность элементов в обычно используемых микрочипах, полученных с помощью фотолитографии, составляет 104-105/см2. При использовании микророботов для нанесения кДНК на поверхность подложки плотность расположения элементов достигает лишь 103/см2. И в том, и в другом случае зондам для гибридизации необходимо диффундировать к мишени, находящейся в индивидуальном элементе микроматрицы, общие размеры которой составляют 1 х 1 см. Поскольку время диффузии зонда пропорционально квадрату расстояния до мишени, общее время гибридизации можно понизить путем увеличения плотности расположения элементов на микрочипе.
Кроме того, одним из подходов к уменьшению времени гибридизации является придание молекулам зондов направленности перемещения к мишеням в электрическом поле, когда микроматрицу располагают на электроде.
