Микроматрицы ДНК: методы создания
Для нанесения нуклеиновых кислот на поверхность подложки используют три подхода: короткие олигонуклеотиды синтезируют прямо на ее поверхности, а также прикрепляют к ней предварительно полученные фрагменты ДНК ковалентными или нековалентными связями.
Чаще всего при создании микроматрицы используют фотолитографическую маску, которую помещают над большей частью микроматрицы, а остающиеся открытыми химические группы активируют светом. Затем происходит соединение 5'-гидроксильных групп фосфорамидитных производных добавляемого нуклеотида с активированным сегментом микроматрицы. Защищая поверхность микроматрицы от света дискретными участками в различных комбинациях, удается синтезировать за 12 этапов все теоретически возможные последовательности тринуклеотидов.
В общем случае для синтеза всех возможных последовательностей длиной в N нуклеотидов требуется 4N синтетических стадии. Длина цепи олигонуклеотида, который может быть синтезирован на микроматрице, лимитируется выходом готового продукта на каждой стадии, который составляет примерно 95%. Так, суммарный выход 25-звенного олигонуклеотида будет составлять всего около (0,95)25 = 28%, поэтому данный метод обычно используют для синтеза олигонуклеотидов, длина которых не превышает 20-25 оснований.
При альтернативном подходе микроматрицы олигонуклеотидов синтезируют на подложке с использованием струйных принтеров: головка принтера движется вдоль подложки и наносит на необходимые участки небольшие количества раствора с фосфорамидитными производными нуклеотидов из индивидуальных резервуаров. Эффективность каждого этапа синтеза составляет 99%, что позволяет синтезировать олигонуклеотиды длиной до 40 оснований с суммарным выходом около 67%.
При конструировании микроматриц, элементы которых содержат индивидуальные кДНК, для нанесения на подложку микропятен чаще всего используют микророботы. Для этого применяют растворы рекомбинантных кДНК длиной 0,5-1,0 т.п.о., очищенных из бактериальных клеток, которые перед применением амплифицируют с помощью ПЦР. Поверхность стеклянной подложки покрывают тонким слоем полилизина или обрабатывают аминосиланом для создания положительного заряда, что обеспечивает возможность электростатического взаимодействия подложки с отрицательно заряженными молекулами кДНК. Недостатком этого способа является неспецифичность электростатических взаимодействий, в которые вовлечены многие участки кДНК, что уменьшает эффективность взаимодействия кДНК с последовательностями анализируемых образцов. Для преодоления этих затруднений с помощью асимметричной ПЦР синтезируют производные кДНК, которые далее ковалентно соединяют с сиалированным стеклом с помощью боргидрида.
Разрабатываются альтернативные конфигурации микроматриц, в которых на поверхности стекла фиксируют сами фрагменты ДНК, анализируемой с помощью олигонуклеотидных зондов. Такой подход был использован для поиска мутаций в гене белка p53 . Дальнейшим расширением этого подхода является нанесение на поверхность стекла кусочков тканей с последующим анализом содержащихся в них ДНК или РНК гибридизацией in situ.
