Расщепление транскрипта в комплексах, прекративших элонгацию
РНК-полимеразы в составе тройных комплексов, включая все три РНК-полимеразы эукариот и РНК-полимеразу E.coli , способны осуществлять эндонуклеазное расщепление растущей цепи РНК вблизи ее 3'-конца. Образующийся в результате более протяженный 5'- концевой фрагмент РНК остается прочно связанным с ферментом, тогда как 3'-концевой фрагмент освобождается из тройного комплекса. При этом каталитический центр РНК-полимеразы остается правильно ориентированным в отношении оставшегося транскрипта и ДНК-матрицы, и она способна продолжать транскрипцию, не образуя в синтезируемой РНК внутренних делеций. Реакция расщепления не является пирофосфоролизом, поскольку в результате пирофосфоролиза формируется фрагмент РНК, содержащий 5'-концевой нуклеозидтрифосфат, а при расщеплении транскрипта РНК-полимеразой образуется фрагмент РНК с монофосфатом на 5'-конце.
Белки E.coli GreA и GreB , а также эукариотический фактор транскрипции TFIIS стимулируют процесс расщепления. Те же факторы и, кроме того, состав тройного комплекса оказывают влияние на размер освобождающегося в процессе расщепления 3'-концевого фрагмента РНК, который может варьировать от 1 до 17 нуклеотидов. В разных тройных комплексах процесс расщепления может происходить мгновенно или растягиваться на несколько часов. Полагают, что кинетика этого процесса зависит от конформации тройного комплекса, которая может быть различной в разных участках матричной ДНК.
Расщепление транскрипта катализируется одним активным центром фермента, ответственным за полимеризацию рибонуклеозидтрифосфатов и пирофосфоролиз РНК. Было показано, что неорганический пирофосфат может индуцировать освобождение олигонуклеотидного фрагмента РНК, содержащего 5'-концевую трифосфатную группу, из тройного комплекса, прекратившего синтез РНК. Это означает, что активный центр РНК-полимеразы, прекратившей транскрипцию, смещается от 3'-конца элонгируемого транскрипта к его 5'-концу, где катализирует пирофосфоролитическое расщепление РНК. Не обнаружено ингибиторов расщепления транскрипта, которые одновременно не подавляли бы самого синтеза РНК. Не найдено и мутантов, у которых оба этих процесса были бы разделены. И, наконец, расщепление транскрипта и полимеризация субстратов происходят в одинаковых условиях: в присутствии двухвалентных катионов с одним и тем же оптимумом рН реакционной смеси.
Физиологическое значение реакции расщепления транскрипта РНК-полимеразой еще предстоит выяснить.
Факторы GreA и TFIIS, стимулирующие расщепление РНК, подавляют образование прекративших транскрипцию комплексов. Расщепление транскрипта помогает РНК-полимеразе выйти из состояния полного прекращения транскрипции. Полагают, что в тройном комплексе, прекратившем транскрипцию, активный центр РНК- полимеразы постепенно смещается от 3'-конца РНК к 5'-концу и утрачивает способность ее элонгировать. Эндонуклеазное расщепление транскрипта правильно ориентирует новый 3'-концевой нуклеотид РНК относительно активного центра РНК-полимеразы, что реактивирует процесс транскрипции. Другой возможной функцией расщепления РНК молекулой РНК-полимеразы может быть коррекция ошибочно включенных в растущую РНК 3'-концевых нуклеотидов. Если после включения некомплементарного матрице нуклеотида в РНК молекула РНК-полимеразы делает паузу в элонгации, то вырезание 3'-концевого фрагмента растущей цепи РНК и продолжение элонгации можно рассматривать как имитацию РНК-полимеразой хорошо известной 3'->5'-экзонуклеазной корректирующей активности ДНК-полимеразы I E.coli. Такой механизм может помогать РНК-полимеразе в преодолении физических препятствий во время транслокации.
Известно, что места задержки транскрибирующей РНК-полимеразы на ДНК распознаются молекулами фермента, находящимися в определенной фазе (рамке считывания) по отношению к этим сайтам. Поскольку отщепление 3'-концевого участка ДНК и обратная транслокация могут перевести фермент в новую фазу по отношению к сайтам задержки на ДНК, то фермент, начиная транскрипцию из нового положения, сможет беспрепятственно преодолевать сайты задержки в процессе элонгации. Одним из таких преодолеваемых при транскрипции барьеров для РНК-полимеразы у эукариот могут быть, в частности, нуклеосомы. Показано, что факторы GreA и GreB стимулируют процесс освобождения промоторов бактериальными РНК- полимеразами.
