Рестриктазы: общие сведения
Среди ферментов, используемых в генной инженерии для клонирования, большое значение имеют эндонуклеазы рестрикции - рестриктазы. Эти ферменты, впервые открытые как часть системы рестрикции-модификации ДНК у бактерий, специфически гидролизуют молекулы двухцепочечных ДНК при наличии в них определенных последовательностей нуклеотидов, называемых сайтами рестрикции . В то же время метилазы используют для ограничения числа сайтов рестрикции и получения более крупных фрагментов ДНК с помощью рестриктаз.
Применение рестриктаз - значительно облегчило работу с рекомбинантными ДНК. Каждая из сотен известных сегодня рестриктаз распознает специфическую короткую (обычно длиной 4 и 6 нуклеотидов) последовательность в двухцепочечной ДНК и расщепляет ДНК только в этом участке ( рис. 65.5 ). Например, рестриктаза HaeIII расщепляет последовательность 5'-ГГЦЦ-3'.
Специфичность рестриктаз - мощный инструмент для разрезания больших геномов. В результате обработки рестриктазой геномная ДНК человека расщепляется на сотни тысяч фрагментов, длиной от нескольких нуклеотидов до нескольких тысяч нуклеотидов. Состав и размер фрагментов зависит от типа используемой рестриктазы. Используя несколько рестриктаз, можно составить подробную карту рестрикционных сайтов для любого фрагмента ДНК длиной от нескольких сотен до десятков тысяч нуклеотидов.
Рестриктазы, расщепляющие ДНК в далеко отстоящих друг от друга точках, используют для составления карт ДНК длиной в миллионы нуклеотидов.
По изменениям в последовательности рестрикционных сайтов выявляют полиморфные участки или мутации в геноме человека.
