Рибозимы: репарация мутантных РНК
Дж.Т.Джонс с соавторами (1996 г.) удалось приспособить рибозимы для восстановления генетической информации на уровне молекул РНК, структура которых нарушена мутациями. Рибозим интрона группы I Tetrahymena после генно-инженерных модификаций оказался способным выполнять такие репарирующие функции.
Аутосплайсинг транскриптов, содержащих интроны группы I, начинается с расщепления фосфодиэфирной связи между 5'-концевым экзоном и прилегающим к нему интроном, сопровождаемого полным удалением интрона и лигированием фланкирующих его экзонов, приводящим к восстановлению непрерывной структуры РНК.
Для использования рибозимов для репарации РНК нужно с помощью генно-инженерных методов к 3'-концу рибозима присоединить вместо 3'-концевого экзона любую другую последовательность, чтобы она соединялась с последовательностью 5'-концевого экзона в строго определенной точке с образованием гибридной молекулы РНК.
Поскольку сайт взаимодействия рибозима с РНК во время транс- сплайсинга и положение точки разрыва РНК определяются внутренней направляющей последовательностью рибозима ( IGS - internal guide sequence ), присоединение новой 3'-концевой последовательности можно осуществлять практически в любом месте РНК-мишени ( рис. II.28 ). Таким образом, для репарации мутационного повреждения в экзоне 2 на уровне РНК IGS делают комплементарной участку РНК-мишени, локализованному выше точки повреждения на стыке экзонов 1 и 2. Экзон 2 дикого типа соединяют с рибозимом, который после взаимодействия с РНК-мишенью вырезает из нее мутантную последовательность экзона 2 и заменяет на эквивалентную последовательность дикого типа. В результате комплекс рибозима и репарированной РНК распадается и обновленная РНК вовлекается в трансляцию.
Такой подход был успешно использован для репарации мРНК гена lacZ в клетках E. coli и в культивируемых клетках животных. Точность транс-сплайсинга, направляемого рибозимом, оказалась абсолютной - в образующихся восстановленных молекулах РНК не наблюдали сдвига рамки считывания.
Однако в этих опытах на первый план вышла другая проблема. Длина IGS-последовательности, определяющей специфичность взаимодействия рибозима с РНК, составляет всего шесть нуклеотидов. Такая последовательность из шести нуклеотидов в молекулах РНК встречается достаточно часто (каждые 4096 оснований). Следствием этого было объединение репарирующего фрагмента РНК не только с РНК-мишенью, но и другими РНК, не имеющими отношения к первой. Выход из сложившейся ситуации возможен в увеличении специфичности действия рибозима путем удлинения IGS. Однако с увеличением длины области комплементарного взаимодействия между рибозимом и РНК будут возрастать прочность этого взаимодействия и, как следствие, затруднение последующего распада каталитического комплекса, что должно сопровождаться ингибированием реакции.
Применение рибозимов в реакциях транс-сплайсинга для корректировки экспрессии мутантных генов на посттранскрипционном уровне рассматривается как весьма перспективное направление в генотерапии .
