Система сопряженного праймирования: с селектируемыми маркерами
В усовершенствованных системах сопряженного праймирования в дополнительный олигонуклеотид вводится мутация, инактивирующая или восстанавливающая в дочерней мутантной ДНК какой-либо селектируемый маркер.
В одной из таких систем, где в качестве вектора используется ДНК фага M13mp18amIV , селектируемым маркером служит амбер-мутация в гене IV. Матричную ДНК получают, выращивая мутантные фаги M13mp18amIV в бактериальных клетках E. coli TG1, содержащих ген- супрессор амбер-мутаций Su2+.
Для проведения мутагенеза одноцепочечную ДНК фага M13mp18am1Y гибридизуют с двумя праймерами, один из которых мутагенизирующий, а другой, комплементарный гену IV, содержит точковую мутацию в амбер-кодоне, восстанавливающую последовательность нуклеотидов дикого типа. После достройки комплементарной цепи ДНК фага M13mp18am1Y, двухцепочечные ДНК вводят в бактериальные клетки Su2-, дефектные по системе репарации. Эти клетки обладают мутаторным фенотипом, поэтому для того, чтобы в мутируемые ДНК не вносить дополнительные мутации, трансформированные бактериальные клетки высевают на газон клеток E. coli Su2- с нормальной системой репарации. При таком подходе фаговые частицы проходят лишь первый цикл развития в клетках с двумя мутациями, а все последующие - в клетках Su2- с одной мутацией. В результате в таких клетках образуются только те фаговые частицы, ДНК которых содержат сайт-специфическую мутацию и восстановленный ген IV.
Аналогичный подход был использован в системе с геном бета- галактозидазы , находящимся в составе векторов серии M13mp . Фаговый ген кодирует альфа-пептид бета-галактозидазы E. coli и комплементирует дефектную бета-галактозидазу бактериальных клеток-хозяев. Введение амбер-мутации в фаговый ген бета- галактозидазы с помощью праймера, используемого в паре с олигонуклеотидом-мутатором, сопровождается потерей дочерними фаговыми частицами способности комплементировать мутантную бета- галактозидазу бактериальных клеток. В результате в образующихся фаговых бляшках отсутствует активность бета-галактозидазы, которая бы расщепляла искусственный субстрат BCIG с образованием продукта, окрашенного в голубой цвет. Вследствие этого бляшки, образованные фаговыми частицами, содержащими ДНК с сайт- специфическими мутациями, не окрашены и их легко отбирать визуально.
