Создание новых ферментов: абзимы
Методами белковой инженерии, на основе иммуноглобулинов, специфически взаимодействующих с динитрофенильными группами антигенов, были получены абзимы, гидролизующие эфиры динитрофенола.
Исходя из того, что имидазол действует в качестве нуклеофильного катализатора при гидролизе карбоксиэфиров в водных растворах, предполагали, что введение остатка гистидина в центр связывания динитрофенильных лигандов иммуноглобулина придаст ему способность осуществлять гидролиз сложных эфиров динитрофенола. В качестве исходного белка при конструировании абзима использовали VL- и VH-фрагменты тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, специфически взаимодействующего с динитрофенильными группами антигенов. VL- и VH-фрагменты представляют собой вариабельные области иммуноглобулина, которые взаимодействуют с антигеном. Фрагмент ДНК, кодирующий VL-область легкой цепи, синтезировали in vitro и экспрессировали в клетках E. coli. При этом в процессе синтеза кодон, кодирующий Tyr-34, был изменен на кодон His, так как было известно, что именно Tyr-34 контактирует с молекулами динитрофенола в комплексах антиген-антитело. Очищенный рекомбинантный VL-фрагмент объединяли с VH-фрагментом тяжелой цепи природного иммуноглобулина, взаимодействующего с динитрофенолом, что приводило к образованию так называемого Fv- фрагмента.
Оказалось, что такой мутантный Fv-фрагмент способен катализировать гидролиз кумаринового эфира 5-(2,4- динитрофенил)аминопентаноевой кислоты в 90 000 раз более эффективно, чем 4-метилимидазол, и начальная скорость гидролиза была в 45 раз выше, чем у Fv-фрагмента дикого типа. При этом мутантный Fv-фрагмент был неактивен в отношении аминопропаноевого (n=2) и аминогексаноевого (n=5) аналогов субстрата.
Таким образом, с помощью замены единственной аминокислоты в антигенсвязывающем центре иммуноглобулина удалось создать на его основе высокоспецифичный гидролитический фермент, а сам процесс его конструирования был основан на знании молекулярных механизмов катализа и взаимодействия антигенов с антителами.
