Сплайсинг белков: механизм
Для объяснения механизма белкового сплайсинга предложена модель, разработанная группой Ф. Перлера ( рис. I.44 ). В соответствии с этой моделью белковый сплайсинг является аутокаталитическим процессом и для своего осуществления не требует других кофакторов в дополнение к самому полипептиду- предшественнику.
Событием, запускающим белковый сплайсинг, может быть нуклеофильная атака OH-группой консервативного остатка Ser, расположенного в C-концевом сайте сплайсинга, по карбонильной группе пептидной связи, расположенной в N-концевом сайте сплайсинга, или N-O-сдвиг в N-концевом сайте сплайсинга с последующей атакой OH-группой C-концевого сайта и переэтерификацией. В результате функционирования обоих механизмов образуется разветвленное промежуточное соединение, которое при участии остатка Asn распадается на интеин-сукцинимид и экстеины, связанные друг с другом сложноэфирной связью. Эта связь преобразуется в пептидную в результате N-O-сдвига.
Генетическая мобильность последовательностей интеинов в ДНК является одной из самых больших неожиданностей, обнаруженных после их открытия. Оказалось, что полипептидная цепь интеина обладает эндонуклеазной активностью, которая обеспечивает транспозиции последовательностей интеинов в геноме. Аналогичный процесс, ранее получивший название " хоуминга интронов ", описан у интронов группы I . В результате хоуминга происходит однонаправленный перенос копии последовательности ДНК интрона (или интеина) из гена, содержащего эту последовательность, к аллельному гену, не содержащему ее. Данная цепь реакций инициируется эндонуклеазным разрывом обеих цепей ДНК в аллельном безинтеиновом гене, образующемся под действием эндонуклеазы интеина. Далее с использованием последовательности ДНК интеина в качестве донора информации происходит репарация двухцепочечного разрыва, которая сопровождается конверсией гена с включением в его состав последовательности интеина. Это указывает на большое сходство механизмов хоуминга интронов группы I и интеинов.
Сплайсинг белков является сложной задачей для исследования in vitro. Процесс вырезания последовательности интеина происходит настолько быстро, что не удается обнаружить промежуточные соединения. Проблему удалось решить методами генной инженерии, вставив последовательность ДНК интеина из гена ДНК-полимеразы термофильной бактерии Pyrococcus в одну рамку считывания между геном белка, связывающего мальтозу, и частью гена парамиозина Dirofilaria immitis. Образующийся химерный белок не претерпевал сплайсинга при 12-20*, но при 37-65* сплайсинг индуцировался. Именно с помощью этого подхода удалось обнаружить разветвленные промежуточные соединения, образующиеся при сплайсинге белков. Такой подход позволяет нарабатывать токсические для клетки белки в виде химерных предшественников при низких температурах, которые простым повышением температуры превращаются в полезные белковые продукты.
