Стабильность рекомбинантных белков и РНК
Важным фактором, определяющим уровень экспрессии рекомбинантных генов в реципиентных клетках, является стабильность кодируемых этими генами мРНК и белков.
Замены кодонов в мРНК дрожжей на синонимические приводят не только к снижению уровня трансляции измененных мРНК в клетках дрожжей, но и сопровождаются уменьшением стабильности самих мРНК. Требование достаточного уровня стабильности мРНК является одним из факторов, определяющих давление отбора на использование конкретных синонимических кодонов для кодирования белков. Важную роль во внутриклеточной стабильности мРНК играют элементы ее вторичной структуры. Так, образование шпилек на 3'-конце мРНК препятствует ее деградации под действием бактериальных экзонуклеаз, РНКазы II и полинуклеотидфосфорилазы. Поскольку изменение первичной структуры с учетом возможной вторичной структуры без изменения функциональных свойств представляется сложной задачей, проблема внутриклеточной стабильности рекомбинантных РНК решается путем введения мутаций в гены экзо- и эндонуклеаз бактериальной клетки-хозяина. Так называемые безРНКазные штаммы E. coli применяются в качестве реципиентов рекомбинантных плазмид. В таких клетках повышается стабильность транскриптов рекомбинантных генов, а пониженный внутриклеточный уровень определенных РНКаз способствует более эффективной очистке рекомбинантных белков, так как для многих препаратов ферментов даже незначительные примеси нуклеазной активности бывают нежелательны.
Крупные нативные белки более стабильны в бактериальных клетках. Один из подходов, позволяющих стабилизировать короткие чужеродные пептиды в клетках E. coli, - включение требуемого пептида в состав гибридного белка. В этом случае последовательность нуклеотидов, кодирующую гибридный белок, соединяют в составе экспрессирующего вектора в одной рамке считывания с бактериальным геномом, кодирующим белок (например, геном бета-галактозидазы). Образующийся гибридный белок в своем составе содержит в N- или С-концевой части требуемый пептид, защищенный основным белком-носителем от протеолитической деградации. Для отделения пептида от белка-носителя их соединяют друг с другом последовательностью аминокислот, по которой можно провести специфическое расщепление полипептидной цепи. Если пептиды не содержат метионина, соединение белка-носителя и пептида осуществляют через эту аминокислоту, и отщепление пептида производят с помощью бромистого циана. Такой подход был использован для получения рекомбинантного соматостатина и A- и B- цепей инсулина.
Для разделения рекомбинантного пептида и белка-носителя используют протеолитические ферменты. Требуемый пептид соединяют с белком-носителем с помощью последовательности аминокислот, специфически расщепляемой протеолитическим ферментом, например, пептидазой клостридий (клострипаином) для получения кальцитонина или трипсином для получения бета-эндорфина.
Второй подход, позволяющий защищать рекомбинантные белки от внутриклеточного протеолиза, - выведение их в периплазматическое пространство или окружающую среду после завершения биосинтеза. Рекомбинантные полипептиды соединяют с сигнальными последовательностями аминокислот белков (бета-лактамаза, OmpA, OmpF, PhoA), секретируемых во внешнюю среду и периплазматическое пространство. Так были получены проинсулин , гормон роста человека и бета-эндорфин .
